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文檔簡介
1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,簡稱DON)在小麥赤霉病(Fusarium head blight, FHB)發(fā)病過程中起重要作用,是一種毒性因子。禾谷鐮刀菌的侵染能力依賴于其產(chǎn)生DON的能力,DON單獨處理即可引起較典型的赤霉病癥狀,抗病品種能顯著地降低病穗組織中DON的含量,因而具有不同F(xiàn)HB抗性的品種其籽粒中DON含量也有很大的差別。現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些和抗毒素或降解毒素積累相關(guān)的基因,但由于小麥抗DON是個復(fù)雜的
2、數(shù)量性狀,而且小麥抗赤霉病和抗DON的機理還不清楚,所以從小麥中鑒定一些新的對DON反應(yīng)密切相關(guān)的基因顯得尤為重要。
本研究以高抗赤霉病小麥品種望水白為材料,利用SMART技術(shù)構(gòu)建了DON誘導(dǎo)的小麥穗組織λ噬菌體cDNA文庫,旨在揭示DON誘導(dǎo)后小麥基因的表達(dá)特點并克隆相關(guān)的基因.未擴增文庫的滴度大約為3×106,擴增后文庫的滴度大約為2×109,平均插入片段1053bp,文庫以19個混合池保存。改進(jìn)了基于PCR的噬菌體c
3、DNA文庫篩選方法,用液體分裝的方法,替代了的文庫篩選的關(guān)鍵步驟-涂板分區(qū),省去了噬菌體文庫鋪平板、浸染、培養(yǎng)、劃塊洗脫的操作過程,使篩庫的工作量減少,速度和效率提高。
利用Affymetrix小麥基因組芯片對高抗赤霉病小麥品種望水白經(jīng)DON誘導(dǎo)后穗組織基因表達(dá)特點進(jìn)行了分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),一個編碼PDR型轉(zhuǎn)運蛋白的EST受DON誘導(dǎo)后上調(diào)表達(dá)45倍。根據(jù)該EST設(shè)計引物篩選小麥基因組TAC文庫,得到一個包含該基因的TAC單克
4、隆。利用染色體walking對該單克隆測序,用Softberry軟件進(jìn)行基因預(yù)測,根據(jù)預(yù)測基因的5’和3’非翻譯區(qū)設(shè)計引物,從DON誘導(dǎo)的小麥望水白穩(wěn)組織cDNA中克隆出該轉(zhuǎn)運蛋白基因。該基因基因組全長7377bp,包含19個外顯子,CDS長度為4308bp,編碼1435aa、分子量161kDa的蛋白質(zhì),蛋白序列比對表明該蛋白屬于PDR蛋白家族,將該基因命名為TaPDR1(Triticum asetivum Pleiotropic Dr
5、ug Resistance).利用一套中國春缺體-四體系將TaPDR1基因定位在小麥5A染色體上。半定量RT-PCR表明TaPDR1在望水白穗中受DON和禾谷鐮刀菌誘導(dǎo)表達(dá),表明其參與了植物抗病防御反應(yīng)。該基因在望水白感病突變體中低水平表達(dá)進(jìn)一步證明TaPDR1與赤霉病抗性有關(guān)。TaPDR1的表達(dá)不受與生物脅迫相關(guān)的激素如JA和SA、非生物脅迫因子如熱、冷、傷害和NaCl的誘導(dǎo)。但Ta PDR1受到Al3+和游離Ca2+的誘導(dǎo)表達(dá),推測
6、[Ca2+]i介導(dǎo)了TaPDR1的表達(dá)信號。進(jìn)一步構(gòu)建了雙鏈RNA干擾載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化小麥,初步研究了該基因的功能.
二穗短柄草(短柄草)是一種禾本科新的模式植物,本研究開發(fā)了一個可以在小麥和短柄草中通用的PDR1基因特異引物TR2。從23份短柄草中克隆出39個PDR1同源基因片段,通過對這些基因序列的比對分析,發(fā)現(xiàn)PDR1基因在短柄草中高度保守,同源性在95%~99%。利用在PDR1基因中找到的SNP位點設(shè)計了兩
7、個CAPS標(biāo)記,可以區(qū)分來自于短柄草不同染色體組的PDR1基因的兩個拷貝。利用這兩個CAPS標(biāo)記可以將這些同源基因分成兩種類型E型和H型,系統(tǒng)分析表明每一種類型形成一個組,支持率很高,推測六倍體短柄草中的PDR1基因的2個拷貝分別來自于2個染色體組,試驗中的二倍體可能就是六倍體基因組中的一個染色體組的供體。PDR1基因的兩個拷貝在多倍體中的進(jìn)化速度不同,顯示這兩種類型在年代上的差異,或兩種類型的突變率或受到的選擇壓不同,系統(tǒng)分析同樣表明
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