油菜超量表達(dá)檸檬酸合成酶和植酸酶基因提高抗土壤磷鋁脅迫的研究.pdf

1、鋁毒害和有效磷缺乏是酸性土壤中限制作物生長(zhǎng)的兩個(gè)主要因子。雖然土壤中有效磷很低，但總磷量很高，其中有機(jī)磷占總磷的20%-80%，是植物可吸收利用的潛在磷源。甘藍(lán)型油菜占我國(guó)油菜種植面積的80%以上，但其主產(chǎn)區(qū)土壤偏酸，或酸性，活性鋁偏高，有效磷缺乏。因此，減輕或消除酸性土壤的鋁毒害、提高土壤磷的有效性對(duì)我國(guó)油菜產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。本研究通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，在獲得甘藍(lán)型油菜超量表達(dá)Pseudomonas aerugi

2、nosa檸檬酸合成酶(CS)基因、及整合有胡蘿卜外展蛋白的植酸酶基因phyA和appA的轉(zhuǎn)基因株系的基礎(chǔ)上，利用水培、砂培、土培等方法研究了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鋁毒害和低磷脅迫的抗性、及其生理和分子機(jī)理。獲得的主要結(jié)果如下：
　　 1.通過(guò)篩選鑒定獲得5個(gè)T3代甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)基因株系。利用Southern blotting分析T3轉(zhuǎn)基因植株外源基因的拷貝數(shù)，結(jié)果顯示：超量表達(dá)CS的轉(zhuǎn)基因株系CS3含有兩個(gè)P.aeruginosa CS基因

3、拷貝，而CS6株系含有一個(gè)拷貝；超量表達(dá)phyA的轉(zhuǎn)基因株系P3含有一個(gè)Aspergillus niger phyA基因拷貝，P11株系含有3個(gè)phyA基因拷貝，而超量表達(dá)植酸酶基因appA的轉(zhuǎn)基因株系a18含有兩個(gè)Escherichia coliappA拷貝。利用Northern blotting分析外源基因表達(dá)量，結(jié)果顯示：在mRNA水平上，CS3和CS6株系有較高的P.aeruginosa CS基因表達(dá)量；P3和P11株系有較高的

4、A.niger phyA基因表達(dá)量；a18株系有較高的E.coli appA基因表達(dá)量。卡那抗性篩選結(jié)果顯示，5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系均無(wú)Km抗性分離。
　　 2.超量表達(dá)CS基因的轉(zhuǎn)基因株系CS3和CS6的鋁毒抗性顯著增強(qiáng)。鋁脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系CS3和CS6不僅檸檬酸的分泌量顯著增加，而且蘋果酸的分泌量也顯著高于野生型植株(WT)。轉(zhuǎn)基因株系較高的三羧酸循環(huán)途徑(TAC)相關(guān)的檸檬酸合成酶(CS)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、磷酸烯醇式丙酮

5、酸羧化酶(PEPC)的活性以及較高的檸檬酸和蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)子的表達(dá)量，導(dǎo)致了其有機(jī)酸分泌量的增加。25μM AlCl3處理48 h后，CS3和CS6的相對(duì)主根伸長(zhǎng)量極顯著大于WT，并且長(zhǎng)期50μM AlCl3脅迫下CS3和CS6的生物量顯著高于WT，說(shuō)明在甘藍(lán)型油菜中超量表達(dá)CS基因增強(qiáng)了植株的鋁毒抗性。
　　 3.超量表達(dá)CS基因的轉(zhuǎn)基因株系CS3和CS6的抗低磷脅迫能力增強(qiáng)。低磷脅迫下，CS3和CS6根系分泌的檸檬酸和蘋果酸含量

6、顯著高于WT，并且CS、MDH和PEPC的活性得到顯著提高。盆栽土培試驗(yàn)表明，以FePO4作為土壤中的磷源時(shí)，油菜超量表達(dá)CS基因顯著提高植株從土壤中獲取磷的能力，轉(zhuǎn)基因植株苗期地上部和籽粒中的磷累積量顯著高于WT植株。
　　 4.超量表達(dá)植酸酶基因的轉(zhuǎn)基因株系P3、P11和a18的抗低磷能力增強(qiáng)。在油菜中超量表達(dá)整合有胡蘿卜外展蛋白信號(hào)肽序列的植酸酶基因ex∷phyA和ex∷appA，獲得轉(zhuǎn)基因植株在水培試驗(yàn)中的結(jié)果表明，根組

7、織和分泌的植酸酶活性顯著高于WT。砂培試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)以植酸鈉作為唯一磷源時(shí)，P3、P11和a18株系地上部磷累積量分別比WT植株增加了70.8%、36.8%和19.6%。并且，三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的地上部生物量均顯著高于WT植株。盆栽土培試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)以植酸鈉作為唯一磷源時(shí)，P11和a18株系的籽粒產(chǎn)量分別比WT植株提高了20.9%和59.9%，種子中磷的累積量分別比WT植株增加了20.6%和46.9%。三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系種子的植酸酶活力約為

8、1000 U/kg種子，而WT的種子中沒(méi)有檢測(cè)到植酸酶活性。并且P11和a18株系種子的植酸含量顯著低于WT。
　　 綜上所述，在甘藍(lán)型油菜中超量表達(dá)CS基因不僅提高了轉(zhuǎn)基因株系檸檬酸的分泌量，而且影響了蘋果酸的合成代謝，這兩種有機(jī)酸分泌量的增加提高了轉(zhuǎn)基因株系CS3和CS6的鋁毒抗性和低磷忍耐力。甘藍(lán)型油菜超量表達(dá)融合有胡蘿卜外展蛋白信號(hào)肽序列的植酸酶基因可以顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株根系分泌的植酸酶活性，提高轉(zhuǎn)基因株系對(duì)植酸磷的吸收