耐黃龍病寄主植物RGA的分離鑒定及侵染相關(guān)序列的表達(dá)分析.pdf

1、柑桔黃龍?。℉uanglongbing，HLB）是影響全球柑桔產(chǎn)業(yè)的一種毀滅性病害，會(huì)造成柑桔葉片斑駁、黃化，導(dǎo)致柑桔減產(chǎn)直至植株死亡。該病原菌至今未能得到穩(wěn)定的純培養(yǎng)，因此對其防治方法也受到極大的限制，目前尚未有有效的殺菌制劑，一旦發(fā)現(xiàn)病株就只能通過鏟除并焚燒病樹的方法來阻止黃龍病的傳染。利用抗病品種具有的某些特性來提高植物抗病性是植物病害防治的重要措施。柑橘黃龍病菌的寄主包括蕓香科的多種植物和其他科屬的植物，然而不同的植物種類對病害

2、的感病性有著明顯的差異，因此利用感病性弱甚至是有耐病特征的植物分離其中抗病相關(guān)的基因進(jìn)行抗病育種，對于黃龍病這一類危害極大、防治困難的病害尤其具有重要意義。進(jìn)行抗病育種研究首先需要具有抗病種質(zhì)資源或抗病基因，現(xiàn)有的柑桔品種中具有抗病特征的資源十分有限，從親緣關(guān)系較近的植物屬或科中得到相應(yīng)的抗病相關(guān)基因是進(jìn)行抗病育種的可行辦法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，已通過圖位克隆法、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法等方法分離鑒定到一些植物抗性基因，本研究的目的即是從

3、抗（耐）柑桔黃龍蕓香科植物中克隆抗病基因同源序列，為柑桔黃龍病的抗病育種提供一些基礎(chǔ)材料。
　　本論文的研究內(nèi)容包括：
　?。?）根據(jù)已知植物抗性基因表達(dá)產(chǎn)物的保守區(qū)域核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(nucleotide binding site，NBS)設(shè)計(jì)簡并引物，以田間對黃龍病具有耐病特征的蕓香科寄主植物九里香和柚的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增其抗病基因同源序列(Resistance gene analogs,RGAs)，并對獲得的

4、序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，揭示不同寄主植物抗病基因的多樣性及進(jìn)化關(guān)系；
　　（2）以耐黃龍病的柑桔屬植物柚的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增RGAs，進(jìn)行克隆測序，根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計(jì)特異性引物，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR對RGA在甜橙嫁接HLB后的連續(xù)八次采樣中的表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析。
　　主要的研究結(jié)果有：根據(jù)已知植物抗性基因蛋白NBS保守結(jié)構(gòu)域引用設(shè)計(jì)的5條簡并引物，隨機(jī)組合成六對引物以九里香和柚的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通

5、過RFLP分析和克隆測序，共獲得43個(gè)抗性基因同源序列（Resistance gene analogs，RGAs）。NCBI序列比對結(jié)果顯示43個(gè)片段與已有報(bào)道的抗性基因及已克隆的抗性基因同源序列具有不同程度的同源性，其中有12個(gè)RGAs能翻譯成完整連續(xù)的氨基酸序列。通過Clustalx、DNAMAN等軟件分析RGAs及其推導(dǎo)的氨基酸的同源性，結(jié)果顯示它們都包含NBS-LRR類抗性基因所具有的保守區(qū)域：P-loop、Kinase-2a、

6、GLPLAL，其與已克隆的煙草N、亞麻L6、擬南RPS2、RPS5、RPP8、RPM1等多種抗病基因在保守區(qū)域氨基酸水平上的同源性為37.39％-43.43%，可望進(jìn)一步用于HLB抗病基因的分子篩選及遺傳圖譜的構(gòu)建。以柚的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，RFLP分析后選取6個(gè)差異片段送去測序，經(jīng)測序后通過DNAMAN等軟件對序列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，其中有5個(gè)片段屬于NBS類RGAs，比對結(jié)果顯示其與7個(gè)已知植物R基因的保守結(jié)構(gòu)域相應(yīng)氨基酸序列

7、同源性為19.71%-42.86%。此外，實(shí)驗(yàn)中得到的5條RGAs中，kinase-2a最后一個(gè)氨基酸皆為色氨酸，屬于non-TIR-NBS-LRR類。對甜橙進(jìn)行嫁接黃龍病菌的處理后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對5個(gè)RGAs在HLB侵染過程中的表達(dá)進(jìn)行研究觀察，結(jié)果顯示嫁接黃龍病病芽后的八次采樣中5個(gè)RGA的表達(dá)都有不同程度的變化，初步斷定與黃龍病的侵染相關(guān)。其中，GJ20和GJ31在實(shí)驗(yàn)組第2次采樣中表達(dá)量大幅上升，而在嫁接病原前后其余月份

8、的表達(dá)變化幅度較小，相對比較穩(wěn)定；GJ28在實(shí)驗(yàn)組第4次采樣時(shí)表達(dá)上調(diào)，其余幾個(gè)月表達(dá)趨于穩(wěn)定；GJ10在嫁接病原后3個(gè)月時(shí)表達(dá)下降，其余月份與對照組幾乎達(dá)到平衡；GJ35在嫁接病原后總體表達(dá)較對照組大幅度下調(diào)。根據(jù)表達(dá)情況，進(jìn)一步推測GJ20和GJ31較有可能與HLB菌的相關(guān)抗性基因相關(guān)?，F(xiàn)有研究證明RGA在植物基因組中廣泛存在，本研究中得到的序列為果樹抗病育種提供了潛在的應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，通過病原誘導(dǎo)后RGA的表達(dá)情況的研究為HLB相