水稻兩個(gè)芽鞘紫線相關(guān)基因的圖位克隆與應(yīng)用研究.pdf

1、花青素性狀具有肉眼可見，不影響其他性狀發(fā)育，受多個(gè)基因控制等特點(diǎn)，在雜交種的純度鑒定，目的基因的瞬時(shí)表達(dá)，轉(zhuǎn)基因指示中有重要作用，是研究多基因控制單一性狀的典范，在基因互作研究中占有重要地位。水稻芽鞘紫線是在種子出芽后，胚芽鞘兩側(cè)各出現(xiàn)的一條清晰可見的紫色線條。由于該性狀表達(dá)時(shí)期極早(出芽期)和穩(wěn)定，又具有“雙親芽鞘無(wú)紫線但其F1有紫線”的遺傳現(xiàn)象，為我們和用該性狀快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)地鑒定雜交種純度提供了可能，相關(guān)基因還具有發(fā)展成水稻來(lái)源

2、的色素報(bào)告基因的潛在可能。本研究通過(guò)解剖和細(xì)胞學(xué)觀察、精細(xì)定位、克隆測(cè)序、半定量和定量RT—PCR以及轉(zhuǎn)基因等工作，進(jìn)行正、異常材料的外觀和組織結(jié)構(gòu)比較、候選基因的篩選、紫線功能缺失原因分析、部位表達(dá)特異性和相互關(guān)系分析以及OsAi基因的轉(zhuǎn)基因等研究；通過(guò)回交和雜交育種選育出了易于純度鑒定的雜交組合，對(duì)芽鞘紫線法鑒定雜交種純度的司靠性進(jìn)行了驗(yàn)證。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　 ⑴在有紫線的R25的芽鞘上，對(duì)稱分布著兩條紫線；R2

3、5紫線處的薄壁細(xì)胞小而密集，芽鞘在此處顯得薄而有縊痕，YR25芽鞘的外觀及細(xì)胞學(xué)特征與R25在結(jié)構(gòu)上無(wú)明顯差異，只不過(guò)在相應(yīng)位置無(wú)色素沉積。
　　 ⑵用YII—32A×R25的F2群體將OsAi基因定位于第11染色體的第8563749堿基到8614989堿基之間，該范圍內(nèi)的OsbHLH14基因的同源基因與色素途徑有關(guān)，初步確定其為OsAi基因的候選基因：用中九A×R25的F2群體將水稻色素原基因C定位于第6染色體的RM5754和

4、RM19665之間，這兩個(gè)引物之間有一個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子基因OsC1，與玉米的P1/C1色素基因家族同源，初步確定其為C基因的候選基因。
　　 ⑶OsAi基因在DNA水平上差異較多，在起始密碼和終止密碼間共有24處差異，其中有三處導(dǎo)致氨基酸替換，但我們無(wú)法確定與性狀的相關(guān)性。在突變型YII—32B中，該基因不表達(dá)，使芽鞘紫線不表現(xiàn)。3.2 OsC1基因的差異。無(wú)紫線的YR25的OsC1基因比正常的R25在第三外顯子少10bp，其氨

5、基酸序列移碼并提前終止翻譯，而且移碼區(qū)位于MYB功能區(qū)域，這將無(wú)法啟動(dòng)下游結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。3.3 OsAi基因的結(jié)構(gòu)及mRNA序列。獲得OsAi基因mRNA的序列長(zhǎng)度為1610bp，其中3’端UTR全長(zhǎng)280bp，ORF長(zhǎng)1284bp，5'UTR46bp；該基因共有5個(gè)外顯子，該序列比NCBI和Gramene等網(wǎng)站預(yù)測(cè)的基因結(jié)構(gòu)多了一個(gè)外顯子，且最后一個(gè)外顯子向預(yù)測(cè)的3’端延伸了35bp：預(yù)測(cè)序列第4外顯子實(shí)際含有一個(gè)內(nèi)含子。
　

6、　 ⑷OsAi基因不但在玉米，高粱，葡萄，擬南芥中有垂直同源基因，而且在水稻中還有水平同源基因OsB1，該基因控制紫葉和紫色果皮，OsAi基因同高粱、玉米及水稻中的相關(guān)基因聚成禾本科色素分枝；OsC1基因與高粱、玉米和小麥的相關(guān)基因形成禾本科分枝，與水稻中的其他MYB基因同源性低。
　　 ⑸OsAi基因僅在芽鞘中表達(dá)，其他器官不表達(dá)；OsC1基因在芽鞘和葉片中表達(dá)，其他器官極少表達(dá)：OsAi基因在無(wú)紫線的YR25中的表達(dá)和Os

7、C1基因在無(wú)紫線的YII—32B中的表達(dá)無(wú)大幅的上下調(diào)變化，說(shuō)明OsAi和OsC1基因在芽鞘紫線的表現(xiàn)中是一種互補(bǔ)關(guān)系。
　　 ⑹將OsAi基因全長(zhǎng)及上游1504和下游1052bp，通過(guò)分段載入方式成功載入pCAMBIA1301，轉(zhuǎn)化中花11獲得了4株陽(yáng)性植株，基因驗(yàn)證工作進(jìn)行中。
　　 ⑺通過(guò)回交育種，將有紫線的II—32A改造成了無(wú)紫線的YII—32A，通過(guò)雜交育種，獲得了新的不育系2081A(無(wú)紫線)，兩個(gè)不育系同