水稻心白突變體flo2灌漿期籽粒中miRNA鑒定與表達分析.pdf

1、miRNA作為重要的負調(diào)控因子在植物中廣泛存在，調(diào)控植物生長發(fā)育、響應(yīng)生物和非生物脅迫等各類生物學過程。水稻種子在灌漿期的生長是一個復(fù)雜的生理過程，其發(fā)育程度和物質(zhì)積累狀況決定稻米的產(chǎn)量與品質(zhì)。目前對灌漿期水稻基因表達譜研究以及對一些參與物質(zhì)積累，尤其淀粉合成相關(guān)的基因挖掘已有大量闡述。但目前關(guān)于miRNA在水稻灌漿期是如何表達并在參與怎樣的調(diào)控作用還未見報道。本研究以一個淀粉積累發(fā)生變化的心白突變體flo2和對應(yīng)野生型一個地方秈稻品種

2、白豐B為實驗系統(tǒng)，利用高通量測序和信息學分析小RNA庫，鑒定出在灌漿期表達的水稻miRNA，并通過小RNA芯片，比較灌漿不同時期（乳熟，蠟熟，完熟），以及白豐B和flo2中各個miRNA的表達變化，找出在灌漿期優(yōu)勢表達和變化顯著的miRNA，并通過對靶基因的預(yù)測和功能分析闡述miRNA在水稻灌漿過程中對穎果發(fā)育，尤其是對淀粉積累過程的影響。
　　 從構(gòu)建的兩個水稻灌漿時期白豐B和flo2種子小RNA庫中，通過高通量測序獲得的小R

3、NA序列總數(shù)分別為3240709和3266135個，小RNA種類為974934和1542192個，其中與9311基因組匹配的序列數(shù)為1363246和1990385，測序深度足夠作進一步研究。對數(shù)據(jù)庫中的分析結(jié)果表明20個保守家族和約33個非保守家族的miRNA可以在庫中檢測到。此外還鑒定出了11個新的miRNA和200多個在已知基因座上但不同位置的miRNA變體。
　　 為了進一步研究文庫中鑒定得到的miRNA在灌漿期是如何變化

4、，在flo2和白豐B灌漿的三個時期（乳熟期、蠟熟期和完熟期）分別取樣，通過小RNA芯片來分析miRNA的表達變化。芯片結(jié)果驗證了142個已知miRNA及47個已知miRNA變體的表達;有45個miRNA表達水平較高（信號值大于500）。以花后10天miRNA的表達量為參照，表達量上升的保守miRNA家族有4個，非保守家族5個;表達量下降的保守家族5個，非保守家族4個。8個新miRNA也在芯片結(jié)果中驗證。對應(yīng)白豐B灌漿各時期miRNA的表

5、達量，發(fā)現(xiàn)flo2在花后10天差異顯著(p-value＜0.01)的miRNA最多，說明兩者miRNA表達差異主要發(fā)生在灌漿早期。
　　 對這些miRNA做進一步的靶基因預(yù)測，驗證和功能分析，結(jié)果顯示這些靶基因參與多種生理過程。通過5'RACE驗證部分靶基因，其中miR1862d和miR1874-5p的靶基因GBSS1b和BE1分別參與直鏈淀粉和支鏈淀粉的合成，并且兩者在flo2和白豐B的不同時期積累水平也不一樣。qPCR結(jié)果顯

6、示GBSS1b和BE1也呈現(xiàn)相對應(yīng)的負調(diào)控趨勢，這可能與flo2和白豐B中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量及構(gòu)成存在差異相關(guān)，其中miR1862在flo2乳熟期的表達量要顯著高于白豐B，同時GBSS1b在flo2乳熟期的表達量要低于白豐B，該變化來自miRNA的調(diào)控并影響到flo2的直鏈淀粉含量。Q-PCR結(jié)果顯示大部分靶基因與miRNA表達呈負相關(guān);另一些呈正相關(guān)的miRNA如miR164和miR167，可能因為靶基因?qū)iRNA的表達存在反

7、饋調(diào)控作用。對靶基因的功能分析發(fā)現(xiàn)多數(shù)靶基因參與種子的物質(zhì)積累和成熟過程。
　　 此外，我們還發(fā)現(xiàn)心白突變體flo2的突變基因可能會影響到體內(nèi)miRNA的表達水平。一些預(yù)測能夠標靶該基因的miRNA在flo2中的表達顯著下降，但這種調(diào)控機制目前還不清楚。
　　 本研究通過對水稻穎果發(fā)育時期的miRNA進行分離、鑒定和表達譜分析，發(fā)現(xiàn)了一批在水稻灌漿期高表達并參與物質(zhì)積累和種子成熟途徑的miRNA，并首次發(fā)現(xiàn)miRNA可能