幽門螺桿菌尿素酶B抗原表位的鑒定.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,Hpylori)是一種螺旋狀、微需氧的革蘭氏陰性桿菌，被世界衛(wèi)生組織列為Ⅰ類致癌因子(TypeⅠ carcinogen)。該菌與人的慢性活動(dòng)性胃炎、胃和十二指腸消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)性淋巴組織淋巴瘤(MALT)以及胃腺癌的發(fā)生密切相關(guān)。目前臨床上針對(duì)Hpylori使用的抗生素治療方法并不理想，有著諸多缺點(diǎn)，因此利用疫苗進(jìn)行預(yù)防接種和治療有望成為控制Hpylori感染行之有效方法。尿素酶B

2、亞單位(UreB)是Hpylori的一個(gè)重要保護(hù)性抗原，動(dòng)物模型中也已經(jīng)驗(yàn)證其作為疫苗抗原的安全性和有效性，尋找鑒定其有效的抗原表位對(duì)于Hpylori的診斷、治療和疫苗開發(fā)具有重要的意義。本研究的目的是要篩選出單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C10所對(duì)應(yīng)的B細(xì)胞抗原表位，并對(duì)其免疫學(xué)功能進(jìn)行初步研究。本課題共分為以下三部分：
　　 1.抗幽門螺桿菌UreB單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C10抗原識(shí)別表位的鑒定
　

3、　 通過(guò)多次截短法分段表達(dá)19段UreB片段，并在此基礎(chǔ)上通過(guò)免疫印跡方法逐步確定單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C10所識(shí)別的抗原表位。我們成功構(gòu)建了19個(gè)表達(dá)載體且均實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。免疫印跡方法確定了單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C10所對(duì)應(yīng)的包含15個(gè)氨基酸殘基的抗原表位，名稱分別為UP32(GGGTGPADGTNATTI)、UP35(WMLRAAEEYSMNLGF)、UP38(TLHDMGIFSITSSDS)，分別位于H

4、pylori尿素酶B亞單位(UreB)上第158-172、181-195、349-363位氨基酸殘基。所鑒定出來(lái)的3個(gè)表位通過(guò)ELISA得到進(jìn)一步地證實(shí)，純化的融合表位蛋白能與相對(duì)應(yīng)的單抗及臨床感染Hpylori的病人陽(yáng)性血清發(fā)生特異性的結(jié)合反應(yīng)。以鑒定出來(lái)的抗原表位核苷酸序列為依據(jù)，采用化學(xué)合成法合成表位多肽，分別命名為UP32、UP35、UP38，純度為90％以上。經(jīng)ELISA或Dotblot方法鑒定，ELISA結(jié)果顯示單克隆抗體A

5、1H10、B3D9、A3C10分別與合成肽UP32、UP35、UP38發(fā)生了特異性抗原抗體反應(yīng)，說(shuō)明單抗A1H10、B3D9、A3C10所識(shí)別的抗原表位分別為UP32、UP35、UP38。Dotblot方法鑒定結(jié)果表明單抗B3D9所針對(duì)的抗原表位為UP35。ELISA結(jié)果顯示合成肽與Hpylori的病人陽(yáng)性血清也發(fā)生了結(jié)合反應(yīng)，說(shuō)明病人血清中產(chǎn)生了針對(duì)這些表位的抗體。
　　 2.幽門螺桿菌尿素酶B亞單位(UreB)B細(xì)胞抗原表位

6、的免疫學(xué)功能研究
　　 將純化后的融合表位蛋白免疫小鼠，獲得了較高效價(jià)的抗血清，其效價(jià)高達(dá)1:51200，說(shuō)明我們構(gòu)建的融合表位蛋白能夠很好地激發(fā)機(jī)體的體液免疫應(yīng)答。免疫印跡試驗(yàn)證實(shí)融合表位蛋白產(chǎn)生的抗血清能夠與重組的截短片段UreBM及天然的幽門螺桿菌UreB發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng)。ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫的鼠抗血清能夠很好地識(shí)別相應(yīng)的表位合成肽，同時(shí)也能與天然UreB發(fā)生反應(yīng)。尿素酶活性抑制試驗(yàn)表明，單抗A1H10、B3D9

7、、A3C10對(duì)尿素酶的活性具有較好抑制作用，抑制率可達(dá)70％，多抗血清對(duì)尿素酶的活性也有一定的抑制作用，抑制率可達(dá)50％。
　　 3.呈現(xiàn)表達(dá)串聯(lián)表位及其免疫學(xué)評(píng)價(jià)
　　 通過(guò)基因重組的方法，將串連的表位基因片段敲入到本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建好的減毒沙門菌株S.ty2⊿rfaH⊿ssaV染色體上，與外膜蛋白A7OmpA)的C-端融合表達(dá)于載體菌表面，得到重組菌S.ty2⊿rfaH⊿ssaV-U258，通過(guò)免疫印跡分析證實(shí)目標(biāo)蛋白獲得

8、了表達(dá)。經(jīng)口胃途徑將表達(dá)系統(tǒng)Sty2⊿rfaH⊿ssaV-U258免疫小鼠，高、低劑量組都有效地激發(fā)了機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)外源抗原UreB的免疫反應(yīng)，抗外源抗原的IgG滴度高達(dá)1:3200，抗載體菌的IgG滴度為1:800-1:3200，而且也能夠檢測(cè)到抗原特異性的分泌型IgA的產(chǎn)生，表明口服免疫的兩組均能刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的黏膜免疫反應(yīng)。
　　 總之，本研究通過(guò)分子生物學(xué)與免疫學(xué)結(jié)合的方法鑒定出了單克隆抗體A1H10、B3D9、A3C1