浙江衢州地區(qū)柑橘綠霉菌對抑霉唑和多菌靈的抗性及其抗性分子機(jī)制的研究.pdf

1、柑橘綠霉病(Penicilliumdigitatum)是貯藏柑橘的最主要病害，引起的損失占采后損失的90％以上?；瘜W(xué)防治是控制柑橘綠霉病的最有效的方法，但隨著藥劑的長期使用，抗藥性菌株不斷產(chǎn)生，從而帶來防治效果下降甚至失效的問題。為探討浙江衢州產(chǎn)區(qū)柑橘綠霉菌的對常用藥劑抑霉唑和多菌靈的抗性現(xiàn)狀和分子機(jī)制，本研究評價了來自衢州市，包括柯城區(qū)、衢江區(qū)和開化縣12個貯藏庫的70個柑橘綠霉病菌菌株對抑霉唑和多菌靈的抗性水平及其分子機(jī)制。結(jié)果表明

2、，柯城區(qū)和衢江區(qū)的抑霉唑抗性菌株(最低抑制濃度(MIC)≥0.5μg/mL)的比例分別為77.1％和62.5％。兩地抗性菌株的平均EC50值分別為2.07±1.04μg/mL和2.35±0.73μg/mL，分別是當(dāng)?shù)孛舾芯闑C50的41.4和47倍。而來自開化縣的菌株均對抑霉唑敏感(MIC≤0.1μg/mL)，平均EC50值為0.04±0.02μg/mL?？鲁菂^(qū)和衢江區(qū)的多菌靈抗性菌株(MIC≥10μg/mL)的比例分別為54.3％和

3、54.2％，而開化縣的抗性菌株比例僅為9.1％。
　　 本研究克隆測定8個多菌靈敏感菌株和10個多菌靈抗性菌株的β-微管蛋白基因全長序列，比對分析后發(fā)現(xiàn)敏感菌株的1255位核苷酸序列為TTC，其編碼的氨基酸(200位)為苯丙氨酸，而在抗性菌株中相應(yīng)位點的核苷酸為序列為TAC，編碼的氨基酸為絡(luò)氨酸。除此外，沒有發(fā)現(xiàn)其他與抗性相關(guān)的突變。因此推斷來自浙江衢州的柑橘綠霉病菌對多菌靈的抗性與其β-微管蛋白200位氨基酸由苯丙氨酸突變成絡(luò)

4、氨酸相關(guān)。
　　 已知抑霉唑靶標(biāo)基因(CYP51)啟動區(qū)的4個額外的126bp片段簡單串聯(lián)重復(fù)插入(IMZ-R1)和其中一個199bp片段的插入(IMZ-R2)與柑橘綠霉菌抑霉唑抗性相關(guān)。使用檢測區(qū)分這兩種抗性分子機(jī)制的引物對CYP51A1/CYP51R2，PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，來自衢州的所有抗抑霉唑綠霉菌的抗性分子機(jī)制既不屬于IMZ-R1也不屬于IMZ-R2；測序比較敏感菌株和抗性菌株CYP51基因的全長序列，也未發(fā)現(xiàn)與抗性相關(guān)的點

5、突變。
　　 通過查找柑橘綠霉菌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)兩個CYP51同源基因的EST序列，命名為PdCYP51B和PdCYP51C基因。結(jié)合NCBI上產(chǎn)黃青霉(NS_000201)的同源物種信息，設(shè)計了CYP51B-R/CYP51B-F和CYP51C-R/CYP51C-F兩對引物，成功從抑霉唑敏感菌株P(guān)dKH8菌株中克隆到包括啟動子和編碼區(qū)在內(nèi)PdCYP51B和PdCYP51C兩個全長基因。PdCYP51B包含2919bp，包括17

6、51bp完整的編碼區(qū)，以及它上游742bp的序列和下游425bp的序列，含有3個分別為73bp、51bp、52bp的外顯子，分別位于989bp與1061bp之間，1260bp與1310bp之間，和2376bp與2427bp之間，編碼485個氨基酸序列。PdCYP51B在GenBank中的登錄號為HQ724322.PdCYP51C，包括一個1497bp的開放閱讀框，含有分別位于541bp與596bp，682bp與733bp，823bp與8

7、85bp，1177bp與1242bp，和1292bp與1348bp之間的5個外顯子，編碼496個氨基酸序列。PdCYP51C在GenBank中的登錄號為HQ724324。序列分析表明PdCYP51B基因與煙曲霉(AfCYP51B，XP_749134.1)和小麥赤霉病菌(FgCYP51B，F(xiàn)GSG_01000)有78％和61％一致性。PdCYP51C與禾谷鐮刀菌(FgCYP51C，F(xiàn)GSG_11024)和尖孢鐮刀菌(FoCYP51C，F(xiàn)O

8、XG_13138)有19％的一致性。PdCYP51B與PdCYP51A和PdCYP51C有59％和22％的一致性，而PdCYP51C基因與PdCYP51A有23％的一致性。
　　 克隆、測序并比較8個抑霉唑敏感(IMZ-S)和1個IMZ-R1、1個IMZ-R2，以及6個IMZ-R3菌株的CYP51B和CYP51C基因序列，發(fā)現(xiàn)這些菌株的CYP51C基本一致，未發(fā)現(xiàn)與抗性相關(guān)的點突變，但是，在所有IMZ-R3菌株的CYP51B基因

9、啟動子區(qū)均發(fā)現(xiàn)有一個199bp序列的插入，而該片段在所分析的IMZ-S、IMZ-R1和IMZ-R2菌株中均不存在。因此推測，IMZ-R3菌株的抗性機(jī)制與該菌株的CYP51基因啟動子去的199bp插入相關(guān)。基于該分子機(jī)制，我們設(shè)計了一對檢測IMZ-R3的引物，對來自衢州的IMZ-R3菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，能從所有這些抗性菌株中擴(kuò)增到預(yù)期的片段。因此，認(rèn)為衢州柑橘綠霉菌的抑霉唑抗性菌株的抗性分子機(jī)制均屬于CYP51B基因啟動子區(qū)有1