殺菌劑在葡萄收獲前殘留限量值及嘧菌胺生物轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、本論文中，對兩種殺菌劑在葡萄收獲前的殘留水平進(jìn)行測定，然后由此得出農(nóng)藥殘留動態(tài)曲線，并確立收獲前殘留限量值。同時，利用雅致小克銀漢霉生物轉(zhuǎn)化嘧菌胺代謝，并對嘧菌胺的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析，最終確定嘧菌胺的代謝機(jī)理和代謝途徑。
　　 首先，對于農(nóng)藥使用后的殘留動態(tài)研究，通過兩種殺菌劑在葡萄生長階段的農(nóng)藥消解動態(tài)進(jìn)行試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)所用的葡萄種植在防雨棚下，以防止雨水對施用后農(nóng)藥的沖刷。實(shí)驗(yàn)中所用殺菌劑唑菌胺酯（18.8％，水分散粒劑）和對甲

2、抑菌靈（50％，可濕性粉劑），分別按照韓國推薦濃度(340、1000mg/L)及其倍濃度(680、2000mg/L)，用背負(fù)式噴霧器進(jìn)行噴霧。通過葡萄生長期間的農(nóng)藥殘留研究，得出農(nóng)藥的消解動態(tài)符合動力學(xué)第一方程。以唑菌胺酯為例，施用濃度為340mg/L時，葡萄中殘留消解曲線方程為y=5.7072e-0.0413t，其相關(guān)系數(shù)R2=0.8549，生物半衰期為14天左右;當(dāng)施藥濃度為680mg/kg時，唑菌胺酯的殘留消解曲線方程為y=10.

3、9151-0.0506t，R2=0.9195，生物半衰期為18天左右。并確立唑菌胺酯在收獲前10天的農(nóng)藥殘留最大限量(PHRL10)為2.60mg/kg，收獲前5天的PHRL5為2.28mg/kg。如果在收獲前某時間點(diǎn)的農(nóng)藥殘留量比PHRL5低，那么就預(yù)示著作物在此時間5天后可以收獲，其農(nóng)藥殘留量將比MRL（最大殘留限度）低或者相同而符合國家標(biāo)準(zhǔn)。以對甲抑菌靈為例，施用濃度為1000mg/L時殘留消解曲線方程為y=1.2268e-0.0

4、212t，其相關(guān)系數(shù)R2=0.8668，生物半衰期為17天左右，當(dāng)施藥濃度為2000mg/kg時，對甲抑菌靈的殘留消解曲線方程為y=2.2155e-0.03291t，R2=0.9014，生物半衰期為33天左右。最終得出對甲抑菌靈在收獲前10天的農(nóng)藥殘留最大限量（PHRL10）為2.86mg/kg，收獲前5天的PHRL5為2.39mg/kg。本實(shí)驗(yàn)中，PHRL值是通過高施藥濃度的農(nóng)藥殘留消解曲線得出來的。如果特定時間的農(nóng)藥殘留量低于PHR

5、L值，則能預(yù)測葡萄在收獲前的農(nóng)藥殘留量，確保預(yù)期收獲期葡萄中農(nóng)藥殘留量低于MRL值，對農(nóng)藥的合理，安全使用，起到一定的指導(dǎo)作用。
　　 對于農(nóng)藥使用后的代謝研究，本試驗(yàn)利用雅致小克銀漢霉生物轉(zhuǎn)化嘧菌胺，并對其代謝機(jī)理，途徑及代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析。嘧菌胺是一種能對多種植物病原體起防治作用的殺菌劑。小克銀漢酶屬具有類似于哺乳動物的細(xì)胞色素P450單加酶系統(tǒng)和phaseⅡ藥物代謝酶，其中雅致小克銀漢霉，作為體外哺乳動物藥物代謝模式，被廣

6、泛利用于藥物代謝產(chǎn)物的毒理學(xué)和藥理學(xué)研究。
　　 實(shí)驗(yàn)中，雅致小克銀漢霉液體培養(yǎng)基在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)上培養(yǎng)2天。移走上清液后，菌絲體（大約2g）懸浮于新的PDB(55mL)上，添加嘧菌胺(5mg)后，在一定條件下(27℃，170r/min)培養(yǎng)48h，然后對代謝產(chǎn)物進(jìn)行提取、純化，代謝產(chǎn)物TMS衍生化后用氣相-質(zhì)譜連儀(GC-MS)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雅致小克銀漢霉存在條件下，在12h內(nèi)大約87％的嘧菌胺

7、代謝，同時生成9種代謝產(chǎn)物(M1-M9)。M1，M2和M4是主要代謝產(chǎn)物，分離提純后用核磁共振氫譜(1H-NMR)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，M1的濃度在6h時達(dá)到最大值。M2，比M1有更高的GC-MS響應(yīng)，這種代謝產(chǎn)物在24h時達(dá)到最大值。最初的12h內(nèi)，只檢測到微量M3存在，但其隨后慢慢增多。M4在4h后可以觀察到，然后在24h后到試驗(yàn)結(jié)束前它是量最多代謝產(chǎn)物。
　　 M1和M2的TMS衍生物在m/z311處顯示出分子離子峰，這個峰

8、比嘧菌胺(M+，223)高88Da(-OTMS)，表明那些代謝產(chǎn)物可能是單羥化的嘧菌胺。M1的1HNMR譜圖很好的顯示出苯基環(huán)(δ7.4-7.7ppm)的質(zhì)子共振，而炔取代的甲基基團(tuán)從62.06變到δ4.52，說明這個基團(tuán)中存在羥甲基。M2的1HNMR譜圖中，看出沒有發(fā)生嘧啶上的化學(xué)取代轉(zhuǎn)化，但苯環(huán)有新的共振模式。M3和M4的分子離子峰在m/z399可以觀察到，說明兩個羥基團(tuán)存在于相關(guān)的化合物中。M4顯示出M1和M2結(jié)合的1H-NMR特

9、點(diǎn)，說明嘧啶環(huán)的苯基和炔基支鏈的羥化，另外M5-M9代謝產(chǎn)物各有m/z313(M5)，315(M6)，403（M7-M8）和491(M9)的分子離子峰。m/z222和/或224的碎片離子峰的存在表明M5和M6的嘧啶環(huán)中可能有羥丙烯和羥丙基。在有m/z403的分子離子峰的兩種代謝產(chǎn)物中，M7的質(zhì)譜圖與M6很相似，除了88Da分子重量的增加，其表示有額外的羥基團(tuán)。m/z199的特征碎片離子峰符合（4，6-dimethyl-pyrimidin

10、-2-y(l)）-phenyl-amine。代謝產(chǎn)物M8和M9除了它的分子離子峰，顯示出常見的質(zhì)譜圖特點(diǎn)。例如，m/z287的碎片離子峰是最豐富的離子峰之一，其離子峰可能符合(4-methyl-6-trimethylsilyloxymethyl-pyrimidin-2-y(l))phenyl-amine。這些代謝產(chǎn)物被暫定為M6的二或三羥基衍生物。
　　 為了研究雅致小克銀漢霉生物轉(zhuǎn)化嘧菌胺代謝機(jī)理，分別添加細(xì)胞色素P450(C

11、YP450)的抑制劑增效醚(pB)和黃素單氧化酶(FMO)的抑制劑甲硫咪唑(MZ)。與空白對照實(shí)驗(yàn)嘧菌胺完全代謝相比，PB處理的PDB培養(yǎng)基中，48h后大約30-50％的嘧菌胺代謝。在所有PB(1，10，and100mg/L)處理的培養(yǎng)基中，M3，M4和其它次要代謝產(chǎn)物只有少量存在或者檢測不到。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PB對嘧菌胺的代謝抑制作用明顯。在MZ(1，10mg/L)處理的培養(yǎng)基中，嘧菌胺降解地很快，在48h后檢測不到，而初始量的12％仍然

12、停留在高濃度MZ處理的培養(yǎng)基(100mg/L)中。嘧菌胺及其代謝產(chǎn)物在MZ的最低濃度(1mg/L)處理的培養(yǎng)基中的變化狀況跟其在空白對照實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中沒有區(qū)別，說明MZ對嘧菌胺的代謝抑制作用隨著MZ濃度的增大而更加明顯。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雅致小克銀漢霉可以通過PhaseⅠ氧化酶（CYP和FMO）有幾個不同的途徑有效代謝嘧菌胺。其中FMO可能在嘧菌胺代謝中起著次要的作用，只參與了嘧菌胺代謝的某一特定部分，而CYPs具有廣泛的催化