我國(guó)部分地區(qū)牛支原體病原的分離鑒定及ρ81基因序列分析和蛋白表達(dá).pdf

1、牛支原體（Mycoplasma boris，M.bovis）主要引起牛的肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳房炎等。一旦牛場(chǎng)中存有M.bovis就很難消滅，它將會(huì)不斷地從老年動(dòng)物傳染給新生?；蛐乱M(jìn)的牛，而引起持續(xù)感染。目前已經(jīng)在歐洲和北美引起廣泛的流行并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)于2008年首次發(fā)生牛支原體感染的病例，已有部分省份陸續(xù)出現(xiàn)報(bào)道。
　　 本研究首先對(duì)湖北省患有牛呼吸道疾病的肺臟組織病料進(jìn)行了病原的分離，對(duì)得到的分離物進(jìn)行生化特性鑒定、

2、16S rRNA基因序列比較、特異性PCR鑒別實(shí)驗(yàn)和血清學(xué)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，在40×顯微鏡下可以清楚看到分離物Hubei-1的菌落成明顯的“油煎蛋狀”，具有典型的支原體菌落特征；其生化特性與牛支原體完全吻合。16S rRNA基因序列比較結(jié)果顯不，Hubei-1的16S rRNA序列與牛支原體標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G45株同源性為99.3％，與無(wú)乳支原體（Mycoplasma agalactiae，M.agalactiae）PG2株的同源性為99％。用特

3、異性引物P3/P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以擴(kuò)增出1.9 kb大小的片段，而無(wú)乳支原體則無(wú)擴(kuò)增片段。將擴(kuò)增出的片段克隆至pMD18-T-Vector，送上海生工進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與參考Genbank中登錄的M.bovis PG45株進(jìn)行比對(duì)，證明了分離物是牛支原體，此次為我國(guó)首次分離得到牛支原體。此后，又對(duì)其它7個(gè)省份送檢的牛肺臟用同樣的方法進(jìn)行病原的分離鑒定，得到7株分離株，結(jié)果證明病原均為牛支原體。
　　 實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)從8株

4、支原體分離株擴(kuò)增p81基因，克隆到pMD18-T-Vector，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中送往上海生物工程技術(shù)公司進(jìn)行DNA測(cè)序。結(jié)果表明p81基因全長(zhǎng)2097 bp，我國(guó)分離得到的8株M.bovis分離株之間的同源性為99.4～99.9％，與PG45株同源性94.6％～94.9％，與無(wú)乳支原體PG2株的同源性為73.8％～74％。我國(guó)分離的M.bovis株高度保守，變異率低。M.bovis種內(nèi)高度保守，種間差異較大，p81基因可以作為

5、診斷M.bovis的靶基因，為M.bovis的鑒別診斷提供依據(jù)。
　　 測(cè)序結(jié)果還顯示p81基因在第165、684、1447、1674位密碼子TGA在支原體編碼色氨酸而在大腸桿菌是終止密碼子，TGG在大腸桿菌中編碼色氨酸。設(shè)計(jì)四對(duì)突變引物在此四個(gè)位置進(jìn)行定點(diǎn)突變，將TGA突變?yōu)門(mén)GG，將突變后的p81基因截短成四部分，經(jīng)BamH I和SalⅠ雙酶切后克隆到同樣酶切處理的pET-30a和pET-32a中，經(jīng)PCR、酶切鑒定后的重組

6、質(zhì)粒進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到4段重組蛋白。分別對(duì)重組蛋白進(jìn)行Western blotting和間接ELISA試驗(yàn)，結(jié)果證明，4段重組蛋白在NC膜上均無(wú)反應(yīng)條帶，而ELISA結(jié)果也顯示，只有用P81-3-1455蛋白作為抗原進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，P/N>2.1，證明反應(yīng)成立，可以用于進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)。但是卻與PS2（牛傳染性胸膜肺炎國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)血清）、M.agalactiae PG2陽(yáng)性血清有交叉反應(yīng)。不能用于牛支原體和無(wú)乳支原體、牛肺疫的鑒別診斷。