利用Multiple-primerPCR對種公牛進行個體識別方法的建立.pdf

1、運用種公牛精液基因組中的分子標記進行個體識別可以判斷被檢樣本與目標樣本是否一致。本論文選取來源不同的50支種公牛細管精液，采用正交實驗法優(yōu)化了種公牛精液DNA的提取方法，建立了multiple-primer PCR的反應最佳體系，并分析了可用于個體識別的29對微衛(wèi)星標記，篩選出11對檢測效果良好的引物，建立了利用微衛(wèi)星的個體識別方法。
　　 試驗一、 采用正交實驗法優(yōu)化試劑比例，調整PH值、滲透壓和離子濃度等參數(shù)，建立了種公牛精

2、液DNA的快速提取方法，即在細管精液加入1mL的消化液，其成分：Tris 50 mmol、EDTA 10 mmol、蛋白酶K 100 mg/L、DTT 10 g/L、NaCl 9 g/L、urea 1 mol/L和SDS 2%。混勻后，于58℃消化1 h， 97℃滅活蛋白酶K 10 min，再用苯酚-氯仿方法抽提，可得到高質量的DNA，OD260/OD280為1.84左右。
　　 試驗二、通過調節(jié)PCR增強劑比例和PH值對Taq

3、酶反應環(huán)境進行優(yōu)化，同時對PCR基本成分（Taq酶、MgCl2和dNTP等）進行調整。利用排列組合方法排除干擾引物，篩選出Multiple-PCR反應的最佳體系，即PH=9.7的 10×buffer（Tris-HCl 100 mmol和KCl 500 mmol)2.5 uL，Taq酶10 U，DDT為8 mmol，dNTP為0.8 mmol，甘油5%，二甲亞砜0.25%和甲酰胺0.5%，DNA模板100 ng，上下游引物除MM12為0.

4、26 μL外，其余均為0.13 μL，最后加水至25 μL。反應程序為95℃預變性5 min，94℃變性30 S，退火使用touch-down方式，溫度范圍為65-61℃，時間為40 S，72℃延伸45 S，從第2步到第5步10個循環(huán)，94℃變性30 S，61℃退火40 S，72℃延伸45 S，從第6步到第8步25個循環(huán)，65℃延伸1 h，25℃延伸1 h，4℃保存。通過建立的方法對16個種公牛樣本進行驗證效果良好。
　　 本研