黃河三角洲濱海濕地放線菌多樣性及活性潛力評估.pdf

1、黃河三角洲地處中國暖溫帶，自然資源和生物資源豐富。但同時，由于淡水水源供給不足，加上海陸的共同作用，導致水鹽的平衡失調，土壤鹽堿化程度加重。該濕地的放線菌為了適應鹽堿環(huán)境，可能存在獨特的適應模式以及分子調節(jié)機制，很有可能會產生結構新穎的次級代謝產物。因此，研究黃河三角洲濱海濕地放線菌多樣性對于放線菌資源的開發(fā)和持續(xù)利用具有重大的理論及實踐意義。
　　采用非培養(yǎng)技術分析了黃河濱海濕地環(huán)境中放線菌的多樣性，對來自黃河三角洲濱海濕地四個

2、位點的土壤樣品構建16S rDNA克隆文庫。16S rDNA序列的測序結果表明，位點 BZ10的放線菌類群最多，分布于15個屬中；位點 DY14次之，包括12個放線菌屬；位點DY40得到9個放線菌屬；位點BZ25獲得的放線菌類群最少，僅得到3個不同屬。綜合四個位點分析，黃河三角洲濱海濕地存在豐富的放線菌多樣性，主要分布于放線菌綱（Actinobacteria）和酸微菌綱（Acidimicrobiia）的9個亞目中，分屬于10個科，共包括

3、了22個屬。還有一些不能確定分類地位的類群，有可能代表新的放線菌類群。
　　采用常規(guī)培養(yǎng)方法對包括上述四個位點在內的10個位點的樣品進行了放線菌分離培養(yǎng)，分別采用高氏一號、改良淀粉酪素、ISP5、甘油-精氨酸、GW1、丙酸鈉、M3和改良高氏一號共8種培養(yǎng)基，以制霉菌素、萘啶酮酸鈉和重鉻酸鉀作為抑制劑，共分離得到165株放線菌。通過表觀形態(tài)排重可分屬于8個類群：白孢類群、黃色類群、粉紅孢類群、粉紅紫類群、青色類群、燼灰類群、灰褐類群

4、、金色類群。每種類群中挑選形態(tài)不同的菌株（每種形態(tài)挑選2株）進行16S rDNA測序，結果表明，分離得到的菌株共分布于12個屬，主要為Streptomyces屬和Nocardiopsis屬，還有一些稀有菌屬，其中包括1株Agromyces屬潛在新種。與非培養(yǎng)獲得的放線菌多樣性信息相比較發(fā)現(xiàn)，兩種技術獲得的放線菌多樣性信息差異較大，由于分離培養(yǎng)技術的限制，環(huán)境中大多數(shù)的放線菌目前還不能被分離培養(yǎng)，非培養(yǎng)獲得的放線菌多樣性遠多于純培養(yǎng)獲得菌

5、株類群。
　　對分離菌株合成活性次級代謝物的潛力進行了考察。分別采用 K1F/M6R、FW/RV和 A3F/A7R三對兼并引物進行 I型聚酮合酶（PKS-I）、II型聚酮合酶（PKS-II）和非核糖體肽合成酶（NRPS）功能基因的篩選。其中，有9株放線菌含有I型聚酮合酶基因，有11株放線菌含有II型聚酮合酶基因，有6株菌含有非核糖體肽合成酶基因。部分菌株功能基因的氨基酸序列與 GenBank已知化合物基因序列的最大同源性較低，預示

6、具有合成結構新穎的化合物的潛力。
　　挑選具有代表性的分離菌株進行抑菌活性的初步探索。采用的方法為瓊脂塊擴散法，選擇了9株指示菌：鰻弧菌、溶藻膠弧菌、副溶血弧菌、白色假絲酵母菌、銅綠假單胞菌、鮑曼氏不動桿菌（編號11927）、鮑曼氏不動桿菌（編號11910）、MRSA（甲氧苯青霉素抗性金黃色葡萄球菌）、MRCNS（甲氧苯青霉素抗性凝固酶陰性葡萄球菌）。共得到22株能夠產生抑菌圈的菌株，包括9株鏈霉菌、8株擬諾卡氏菌和5株芽孢桿菌。

7、除了白色假絲酵母菌和銅綠假單胞菌外，其他的指示菌都能被分離得到的某些菌株抑制，而產生大小不等的抑菌圈，其中菌株OAct388表現(xiàn)出的抑菌效果最好，對6株指示菌有抑制作用；菌株OAct363對5株指示菌具有抑菌作用。
　　本論文的研究結果表明，黃河三角洲濱海濕地蘊藏著豐富的放線菌資源，分離得到的很多菌株為I型聚酮合酶、II型聚酮合酶或非核糖體肽合成酶的潛在生產菌株，同時，抑菌活性實驗也顯示出很多菌株具有良好的抑菌活性。非培養(yǎng)技術與可