副豬嗜血桿菌自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AT2-PD與血清抗性的相關(guān)性研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)是全世界養(yǎng)豬業(yè)出現(xiàn)的導(dǎo)致新生仔豬死亡的主要病原之一，近年來，副豬嗜血桿菌桿菌病已經(jīng)給全世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。HPS可作為一種常在菌定殖在豬體的上呼吸道，但是在特定條件下可以侵入機(jī)體并且導(dǎo)致嚴(yán)重的全身性疾病，以纖維素性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征，但是參與全身感染的毒力因子及其致病機(jī)制仍舊沒有研究清楚。
　　 自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是革蘭氏陰性菌V型分泌系統(tǒng)分泌的蛋白，研究

2、發(fā)現(xiàn)它可以抑制細(xì)胞的吞噬作用以及抵抗補(bǔ)體介導(dǎo)的殺傷，幫助菌體克服宿主的天然免疫。HPS中已發(fā)現(xiàn)與毒力相關(guān)的三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(VtaA)，發(fā)現(xiàn)其在HPS中表現(xiàn)出多樣性，并且是很好的疫苗候選抗原。
　　 為了研究自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在抵抗補(bǔ)體介導(dǎo)的殺傷即血清抗性方面可能起到的作用，本論文以副豬嗜血桿菌SH0165中發(fā)現(xiàn)的自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因at2為研究對(duì)象，將at2基因進(jìn)行缺失，然后利用野生菌株和基因缺失株一同進(jìn)行血清殺菌試驗(yàn)，來探究at2基因在H

3、PS血清抗性中的作用。具體內(nèi)容如下:
　　 1電轉(zhuǎn)化法篩選at2-pd基因缺失株
　　 根據(jù)同源重組的原理將at2基因的passenger domain即at2-pd基因的上下游同源臂連接到溫敏質(zhì)粒pSHK3TS上，將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入副豬嗜血桿菌SH0165中，利用溫敏質(zhì)粒在30℃復(fù)制而在41℃不復(fù)制的特性，調(diào)節(jié)溫度控制質(zhì)粒的復(fù)制，達(dá)到篩選缺失株的目的。此方法只得到了發(fā)生單交換的菌株，沒有篩選到發(fā)生第二次單交換的基因缺失株

4、。
　　 2表達(dá)純化AT2-PD蛋白，體外加入蛋白進(jìn)行血清殺菌試驗(yàn)
　　 用SH0165和HPS標(biāo)準(zhǔn)血清型7型菌株(HS1073)一同進(jìn)行血清殺菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)SH0165具有血清抗性，而HS1073很容易被血清殺傷。試圖用HS1073來充當(dāng)基因缺失株的角色，體外加入AT2-PD進(jìn)行血清殺菌試驗(yàn)。利用at2-pd表達(dá)菌株表達(dá)AT2-PD蛋白并將表達(dá)出的65 KDa大小的蛋白進(jìn)行純化。在沒有血清抗性的HS1073與5％健康豬血

5、清進(jìn)行血清殺菌試驗(yàn)時(shí)加入40μg/mL的AT2-PD蛋白一同作用，從體外加入蛋白方面來闡述AT2-PD在血清抗性方面的作用。最終試驗(yàn)結(jié)果說明體外加入AT2-PD蛋白能夠顯著提高HS1073抵抗血清殺傷的能力。但是此試驗(yàn)方法存在其不足之處，需繼續(xù)篩選基因缺失株來明確試驗(yàn)結(jié)果。
　　 3改變方法篩選at2基因缺失株
　　 嘗試接合轉(zhuǎn)移的方法進(jìn)行篩選:將at2-pd基因上下游同源臂連接到自殺性質(zhì)粒pRE112上，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

6、入其受體菌大腸桿菌x7213中，x7213和SH0165進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移，利用Cm抗性平皿進(jìn)行篩選。經(jīng)過多次接合轉(zhuǎn)移均未成功，后試驗(yàn)驗(yàn)證cm抗性基因不能在SH0165中發(fā)揮作用，故放棄此篩選方法。
　　 最后采用自然轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行篩選:將at2基因上下游同源臂兩端加上USS序列(ACCGCTTGT)，上游和下游同源臂中間連接gm抗性片段，命名為UGD，將UGD片段連接到自殺性質(zhì)粒pK18mobsacB上，重組質(zhì)粒與41株HPS菌株進(jìn)行

7、自然轉(zhuǎn)化，利用Gm抗性進(jìn)行篩選。最終得到了兩株at2基因缺失株:CF7066-△at2和WH7111-2-△at2，經(jīng)過PCR、Western blot和Southern blot等方法鑒定at2基因的缺失。
　　 4用at2基因缺失株和野生菌株進(jìn)行血清殺菌試驗(yàn)
　　 得到了at2基因缺失株后，用CF7066和CF7066-△at2一同與90％的健康豬血清進(jìn)行血清殺菌試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明與SH0165相比，副豬嗜血桿菌CF

8、7066野生菌株抵抗血清殺傷的能力較弱，并且基因缺失株和野生菌株存活率并沒有顯著的差異，說明at2基因在CF7066菌株的血清抗性方面沒有發(fā)揮作用。
　　 綜上所述，對(duì)于HPS基因缺失的方法經(jīng)過了長(zhǎng)時(shí)間的摸索，最終利用自然轉(zhuǎn)化法得到了CF7066和WH7111-2的at2基因缺失株;篩選到缺失株之前，體外加入AT2-PD蛋白后HS1073抵抗血清殺傷的能力有顯著提高，這說明at2基因與HPS的血清抗性相關(guān)，但此試驗(yàn)存在其不足之處