龍須菜紫外誘變育種及抗逆速生優(yōu)良品系的選育.pdf

1、龍須菜（Gracilariopsis lemaneiformis）是我國(guó)重要的產(chǎn)瓊膠紅藻，目前已經(jīng)成為我國(guó)繼海帶和紫菜之后的第三大栽培海藻。野生型龍須菜自然分布在我國(guó)的山東半島的潮間帶，其最適的生長(zhǎng)溫度是12-23℃。隨著龍須菜養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，其耐高溫性、生長(zhǎng)速率及瓊膠含量仍亟待提高，以擴(kuò)大其栽培地域并延長(zhǎng)栽培時(shí)間，進(jìn)一步提高產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量。因此有必要對(duì)其進(jìn)行遺傳改良，選育出更具應(yīng)用價(jià)值的新品種。
　　本研究首次以龍須菜四分孢子

2、和果孢子做為材料進(jìn)行紫外線輻射誘變，以耐高溫和生長(zhǎng)速率作為主要性狀篩選抗逆速生突變體，就高溫脅迫對(duì)突變株與981和野生型藻體的生理和分子特性等方面的影響進(jìn)行了比較分析。本文旨在探索適于龍須菜的遺傳育種方法，建立一套耐高溫品系的篩選方法，為選育龍須菜的高產(chǎn)抗逆品系，并進(jìn)一步將其應(yīng)用于生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。
　　誘變育種是龍須菜新品種選育的重要手段之一。本實(shí)驗(yàn)選擇放散剛附著在平皿中的四分孢子（單倍體）和果孢子（二倍體）作為紫外誘變的材料，確定

3、了其紫外誘變條件分別為20W紫外燈，照射距離為30cm，照射時(shí)間為45s和48s。建立了龍須菜四分孢子和果孢子的紫外誘變技術(shù)方法。實(shí)驗(yàn)中觀察到了單倍體四分孢子和二倍體果孢子的紫外誘變效果的差異，四分孢子紫外誘變后，觀察到細(xì)胞出現(xiàn)了色素凝集現(xiàn)象，而誘變后的果孢子沒有；四分孢子紫外誘變后，經(jīng)高溫脅迫篩選到了6株色素突變體，而在誘變后的果孢子中沒有獲得色素突變體。研究結(jié)果顯示，剛放散附著的四分孢子和果孢子均為單個(gè)細(xì)胞，是紫外誘變的良好材料。<

4、br>　　本實(shí)驗(yàn)成功建立起了一套龍須菜耐高溫藻株的篩選方法。針對(duì)龍須菜在不同發(fā)育階段耐高溫性可能會(huì)不同，設(shè)置了在其不同發(fā)育階段都進(jìn)行高溫脅迫篩選。配子體的耐高溫篩選分為三個(gè)階段，分別在四分孢子發(fā)育到盤狀體期（誘變2周后）、直立體期（誘變6周后）和成熟藻體（海上掛養(yǎng)采回）時(shí)，在培養(yǎng)箱中經(jīng)35℃高溫脅迫72h，經(jīng)過(guò)三個(gè)時(shí)期篩選后最終存活的藻體，被初步確定為耐高溫配子體。四分孢子體的耐高溫篩選分為兩個(gè)階段，在果孢子發(fā)育到5cm長(zhǎng)幼苗期（誘變8

5、周后）時(shí)，采用41℃水浴高溫脅迫30min，將存活的藻體經(jīng)海上掛養(yǎng)至成熟藻體時(shí)（海上掛養(yǎng)采回），再經(jīng)過(guò)在培養(yǎng)箱中35℃高溫脅迫72h，經(jīng)過(guò)兩個(gè)時(shí)期篩選最終存活的藻體，被初步確定為耐高溫四分孢子體。
　　通過(guò)高溫篩選，初步獲得了具有耐高溫、生長(zhǎng)快速等優(yōu)良性狀的雌配子體和四分孢子體突變株各兩株，比較了突變株與981和野生型藻體在高溫脅迫下的生理響應(yīng)，包括它們?cè)诤Ｉ虾蛯?shí)驗(yàn)室內(nèi)的日平均生長(zhǎng)速率（SGR），在32℃熱脅迫下藻體內(nèi)丙二醛（MD

6、A）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、脯氨酸含量和熱激蛋白基因（hsp70）表達(dá)等方面的變化，測(cè)定了藻體的瓊膠含量。
　　研究結(jié)果顯示，兩株雌配子體在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和海上的日平均生長(zhǎng)速率與981差異不顯著，但明顯高于野生型，四分孢子體突變株的日平均生長(zhǎng)速率均明顯高于981和野生型，推測(cè)四分孢子體可能因?yàn)槎扼w的原因，具有明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)；在熱脅迫后，配子體和四分孢子突變體MDA含量和增加的幅度均明顯低于野生型，SOD活性高于野生型，脯氨

7、酸含量的累積高于野生型，hsp70基因的表達(dá)水平也顯著高于野生型，顯示了明顯的抗逆性。這些結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了該四株突變?cè)弩w比野生型具有更強(qiáng)的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)和耐高溫性?；谶@些分析結(jié)果將有助于龍須菜耐高溫品系的選育。
　　研究發(fā)現(xiàn)，不同耐熱性的藻體在整個(gè)熱脅迫過(guò)程中各種生理和分子指標(biāo)的變化趨勢(shì)是一致的。熱脅迫下，藻體的MDA含量一直處于升高的趨勢(shì)，由于MDA是膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，說(shuō)明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熱脅迫導(dǎo)致細(xì)胞膜受到損害的程度增加。所有的藻

8、株SOD活性在第一天內(nèi)呈上升趨勢(shì)，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)活性降低。熱脅迫后較短的時(shí)間內(nèi)SOD活性升高，有利于保護(hù)細(xì)胞免受氧化脅迫的傷害。推測(cè)隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD酶的活性受到抑制，使細(xì)胞受損害程度增加，導(dǎo)致脅迫過(guò)程中MDA含量的持續(xù)升高。脯氨酸在非酶促抗氧化系統(tǒng)中起著重要的作用，在熱脅迫后脯氨酸含量呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)，顯示了在脅迫初期能夠有效地提高藻體的抗逆性。藻體經(jīng)4h高溫脅迫后，hsp70基因的表達(dá)水平顯著增高，說(shuō)明hsp70基