IK細(xì)胞因子在牛植入前胚胎和牛胎兒成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及作用.pdf

1、細(xì)胞因子IK(IKcytokine)是Ⅱ類主要組織相容性復(fù)合物(majorhistocompatibilitycomplex，classⅡ，MHCⅡ)下調(diào)因子，該基因編碼的蛋白因含有多個(gè)精氨酸(arginine，R)、谷氨酸(glutamicacid，E)和天冬氨酸（asparticacid，D）殘基重復(fù)序列又名RED蛋白。MHCⅡ分子只在抗原提呈細(xì)胞（antigen-presentingcell，APC）中表達(dá)，如巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、已

2、活化的T細(xì)胞、樹突細(xì)胞等;在不表達(dá)MHCⅡ分子的非抗原提呈細(xì)胞中，多種細(xì)胞因子，如干擾素γ（interferonγ，IFNγ）可誘導(dǎo)MHCⅡ分子的表達(dá)。細(xì)胞因子IK的功能就是抑制MHCⅡ分子在非抗原提呈細(xì)胞中的誘導(dǎo)性表達(dá)，對(duì)維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)定具有重要作用。
　　本研究通過(guò)mRNA差異顯示PCR方法(mRNAdifferentialdisplayreversetranscriptionpolymerasechainreaction，m

3、RNADDRT-PCR)發(fā)現(xiàn)ik在牛植入前胚胎發(fā)育不同時(shí)期差異表達(dá)，實(shí)時(shí)定量PCR(quantitativereal-timePCR，qPCR)結(jié)果顯示在生發(fā)泡期卵母細(xì)胞(germinalvesicle，GV)、第二次減數(shù)分裂中期卵母細(xì)胞（secondmeioticmetaphase，MⅡ）和2細(xì)胞期胚胎中，ik表達(dá)量隨發(fā)育階段進(jìn)展而下調(diào);達(dá)到8細(xì)胞胚胎期，其表達(dá)量上調(diào)，并且達(dá)到植入前各發(fā)育階段中表達(dá)量高峰;隨后再次下調(diào)，到囊胚期時(shí)的表

4、達(dá)水平低于MⅡ期。據(jù)此確定細(xì)胞因子ik是一個(gè)牛植入前胚胎發(fā)育差異表達(dá)基因。用IK特異性抗體對(duì)體外受精合子、2細(xì)胞期、8細(xì)胞期胚胎、桑椹胚及囊胚的免疫熒光染色結(jié)果顯示，IK在8細(xì)胞期前的發(fā)育階段中無(wú)蛋白表達(dá)，從8細(xì)胞期開(kāi)始在細(xì)胞核內(nèi)有少量蛋白表達(dá)，至桑椹胚期各細(xì)胞核內(nèi)均有IK蛋白表達(dá)，囊胚中滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞核中均有其蛋白表達(dá)。對(duì)受精后0h受精卵進(jìn)行小干擾RNA（smallinterferenceRNA，siRNA）胞質(zhì)顯微注射干擾

5、ik表達(dá)，并以注射等量發(fā)育液的胚胎為對(duì)照組，qPCR檢測(cè)注射后24h的2細(xì)胞胚胎期干擾效率為79％(P＜0.01)。統(tǒng)計(jì)干擾組與對(duì)照組胚胎發(fā)育率，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子ik在受精卵期的下調(diào)可降低卵裂率和8細(xì)胞胚胎率(P＜0.05)，而對(duì)囊胚率則無(wú)顯著影響(P＞0.05)。進(jìn)一步的qPCR顯示，在注射后48h的8細(xì)胞胚胎期，ik表達(dá)量顯著上升，且干擾組與正常發(fā)育組胚胎中的表達(dá)量無(wú)顯著差異(P＞0.05);囊胚期干擾組胚胎中的ik表達(dá)量為正常發(fā)育組胚

6、胎中表達(dá)量的0.74倍(P＜0.01)。對(duì)ik干擾的2細(xì)胞期胚胎、8細(xì)胞期胚胎和囊胚進(jìn)行免疫熒光染色，染色結(jié)果與正常發(fā)育胚胎無(wú)差別。這表明，在8細(xì)胞胚胎期發(fā)生的合子基因組激活(zygotegenomeactivation，ZGA)活化了ik基因的轉(zhuǎn)錄，新合成的mRNA補(bǔ)充了卵母細(xì)胞的ikmRNA儲(chǔ)備，對(duì)siRNA誘導(dǎo)的沉默進(jìn)行了補(bǔ)償;到囊胚期，ik轉(zhuǎn)錄減弱，siRNA的干擾效果得以顯現(xiàn)。
　　在8細(xì)胞期胚胎期前的發(fā)育階段，胚胎中雖

7、然有ikmRNA表達(dá)但并沒(méi)有蛋白表達(dá)，然而在這期間干擾ikmRNA導(dǎo)致卵裂率和8細(xì)胞胚胎率降低，這表明在這期間可能有免疫熒光染色檢測(cè)不到的少量IK蛋白表達(dá)，并且這少量的IK蛋白對(duì)卵裂和8細(xì)胞胚胎發(fā)育有重要作用。而在8細(xì)胞期胚胎中ikmRNA表達(dá)量達(dá)到高峰并開(kāi)始有大量蛋白表達(dá)，說(shuō)明ik在8細(xì)胞胚胎期有重要作用。由于這些大量表達(dá)的mRNA影響了之前siRNA的干擾作用而檢測(cè)不到干擾效果，因此囊胚發(fā)育未受到影響。
　　qPCR對(duì)ik下游

8、基因牛Ⅱ類組織相容性復(fù)合物bola-drb3(Bostaurusmajorhistocompatibilitycomplex，classⅡ，DRB3)及Ⅱ類組織相容性復(fù)合物反式活化蛋白ciita(classⅡ，majorhistocompatibilitycomplex，transactivator)的檢測(cè)結(jié)果顯示bola-drb3與ciita在GV期、MⅡ期和2細(xì)胞胚胎中的mRNA表達(dá)量均維持較低水平，而在8細(xì)胞期均提高表達(dá)且達(dá)到峰值

9、，在囊胚中mRNA表達(dá)量均降低至與8細(xì)胞胚胎前期的表達(dá)水平。對(duì)ik干擾組胚胎bola-drb3和ciita的qPCR結(jié)果顯示在2細(xì)胞期、8細(xì)胞期胚胎和囊胚中，兩基因的mRNA表達(dá)量均有降低。用CIITA特異性抗體對(duì)體外受精2細(xì)胞期、4細(xì)胞期、8細(xì)胞期胚胎、桑椹胚及囊胚和siRNA干擾ik表達(dá)的8細(xì)胞期胚胎、桑椹胚及囊胚的免疫熒光染色結(jié)果顯示CIITA在植入前各階段胚胎中均沒(méi)有蛋白表達(dá)。說(shuō)明干擾ik表達(dá)不會(huì)引起胚胎MHCⅡ表達(dá)失調(diào)。

10、>　　綜上所述，在牛植入前胚胎中ik的表達(dá)受到嚴(yán)格的調(diào)控，不容易受到外源干擾RNA影響，對(duì)維持植入子宮時(shí)期MHCⅡ分子在胚泡表面不表達(dá)或低表達(dá)具有重要作用。
　　用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞因子ik在牛胎兒成纖維細(xì)胞中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)其豐度較高，而ciita和bola-drb3沒(méi)有表達(dá)，同時(shí)有研究證明ik在Hela細(xì)胞中具有激活紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)(spindleassemblycheckpoint，SAC)的功能，因此為了確定細(xì)胞因子IK在牛

11、胎兒成纖維細(xì)胞中的功能是否與SAC相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了ik過(guò)表達(dá)和干擾表達(dá)對(duì)SAC成員mad1、mad2及cdc20表達(dá)的影響。結(jié)果表明干擾ik表達(dá)并不影響SAC成員的mRNA表達(dá)水平，而過(guò)表達(dá)ik則會(huì)顯著提高SAC關(guān)鍵組分mad2和cdc20的mRNA表達(dá)。推斷ik對(duì)SAC的作用可能不是必要條件而是充分條件，即ik低表達(dá)不會(huì)抑制SAC功能，但其高表達(dá)可以促進(jìn)SAC功能。
　　本研究從牛胚胎發(fā)育和牛胎兒成纖維細(xì)胞兩個(gè)方面檢測(cè)細(xì)胞因子