外文翻譯(中文)纖維蛋白-磷灰石復(fù)合材料的仿生制備

1、<p><b>　　中文4790字</b></p><p>　　纖維蛋白-磷灰石復(fù)合材料的仿生制備</p><p>　　Rui Yoh, Takuya Matsumoto, Jun-ichi Sasaki, Taiji Sohmura</p><p>　　摘 要：雙向擴(kuò)散的Ca和PO4的溶液加入到纖維蛋白凝膠中，在不同pH條件下和氟

2、離子的濃度進(jìn)行仿生礦化反應(yīng)生成有機(jī)/無機(jī)模仿生物礦化復(fù)合材料。在這個系統(tǒng)中產(chǎn)生的礦物比在溶液礦化系統(tǒng)中產(chǎn)生的礦物具有較高的結(jié)晶度。在纖維蛋白凝膠中由于pH條件不同生成的礦物也不同，如下所示：當(dāng)不受酸堿約束下獲得的礦物是DCPD；當(dāng)PH是7.4時，獲得的礦物是DCPD和OCP的混合物；當(dāng)PH是9.0時，獲得的礦物是OPD和HAP的混合物。當(dāng)氟離子濃度在2-500ppm變化時，在PH是7.4時，凝膠系統(tǒng)中產(chǎn)生的礦物也在改變，從OCP/HAP

3、復(fù)合材料轉(zhuǎn)變?yōu)镠AP/ FAP復(fù)合材料。此外，所獲得的礦物的結(jié)晶度隨隨氟離子在增加而增加，同時晶度和溶解度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系?？傊覀兘⒘诵碌挠袡C(jī)/無機(jī)復(fù)合材料合成方法，這種材料是由纖維蛋白和鈣磷酸鹽組成的，同時表明合成的礦物特征可由制備條件控制。</p><p>　　關(guān)鍵詞：仿生材料 ， 生物礦化 ，鈣磷酸鹽，水凝膠，氟離子</p><p><b>　　引 言</b>

4、</p><p>　　經(jīng)過深入的研究表明，在骨組織工程學(xué)領(lǐng)域，有機(jī)或者無機(jī)的復(fù)合材料與骨組織具有良好的生物相容性，能夠提高它們的機(jī)械性能和促進(jìn)骨組織再生。大多數(shù)有機(jī)或無機(jī)復(fù)合材料都是幾種簡單的有機(jī)或無機(jī)材料經(jīng)過復(fù)合制備的，但是模擬生物硬組織的復(fù)合材料的制備方法并沒有被很好的介紹。</p><p>　　生物硬組織，例如骨骼和牙齒的釉質(zhì)，是在細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中鈣磷酸鹽環(huán)境中經(jīng)過成核，晶體生

5、長而形成的。例如，骨鈣蛋白或者別的非膠原蛋白，是通過典型的I膠原質(zhì)化學(xué)連接的，它們和羥基磷灰石（HAP）具有良好的生物相容性。在釉質(zhì)的形成過程中，自我組成的納米釉源蛋白調(diào)節(jié)磷灰石的晶體形態(tài)，因此，ECM扮演中重要的角色，它不僅提供場所供礦物結(jié)晶沉淀而且對于生物硬組織的生長能夠控制生物礦物的成核，結(jié)晶形態(tài)和結(jié)晶方向。在多樣的水凝膠方向，一些研究已經(jīng)開始使用鈣化系統(tǒng)和嘗試了解基質(zhì)蛋白在生物礦化過程中的作用。例如Boskey et al曾建立

6、了動物膠和瓊脂糖膠 的擴(kuò)散系統(tǒng)，證明非膠原蛋白在HAP的制備過程中起到促進(jìn)還是抑制作用。Hunter et al.曾使用丙烯酰胺凝膠 研究它在體外的礦化過程。因此在有機(jī)基質(zhì)中礦物的形成被認(rèn)為是模擬生物硬組織生長礦化方法的一種。這些有機(jī)或無機(jī)復(fù)合材料經(jīng)過仿生過程制備可能對于骨組織工程學(xué)的研究有非常大的作用。但是在以上提到的凝膠系統(tǒng)中無機(jī)相的制備大多數(shù)是由結(jié)晶度低的磷灰石組成的。在骨組織工程中，控制好無機(jī)相在復(fù)合材料中的性能是非常必要的，這

7、是因?yàn)椴牧显卺t(yī)學(xué)治療應(yīng)用上需要</p><p>　　在HAP中加入氟化物能夠提高材料的穩(wěn)定性，這是通過在晶格中用氟離子取代氫氧離子。氟離子在血清中濃度為0–0.13 ppm，但是在骨組織中濃度提高到800ppm，釉質(zhì)中達(dá)到350-1000ppm。因此，對于生物硬組織的生長過程中，氟化物在調(diào)節(jié)礦物性能上顯然起到關(guān)鍵作用。除此之外，在礦化過程中，PH也是一個重要的因素。因此在礦化過程中，控制復(fù)合材料中無機(jī)性能這些因素

8、都是非常重要的參數(shù)。</p><p>　　在組織工程學(xué)上使用纖維蛋白凝膠是非常有益的，這是因?yàn)樗哂猩锵嗳菪院蜕锝到庑浴８匾氖抢w維蛋白能夠從個人的周圍血提取，因此在這次研究中我們選擇纖維蛋白作為有機(jī)成分。在這次的研究中，在不同的條件下，我們使用纖維蛋白凝膠進(jìn)行體外礦化和研究在凝膠中生成的礦物的性能是為了獲得無機(jī)成分在有機(jī)或無機(jī)復(fù)合材料中多樣性的特點(diǎn)。</p><p><b&g

9、t;　　材料和方法</b></p><p>　　體外纖維蛋白凝膠的礦化過程</p><p>　　凝膠擴(kuò)散系統(tǒng)的制備過程如下：纖維蛋白（4mg/mL)和凝血酶溶液（2.5單位/mL）以1:1比例混合均勻。取240μL溶液倒入聚乙烯試管（直徑=8mm）在37。C保溫箱中放置30分鐘以便于凝膠。100 mM 的(CH3COO)2Ca.2H2O和60mM的 NH4H2PO4溶液以相反的

10、方向倒入以制好的凝膠促進(jìn)礦化作用，如圖一所示。整個系統(tǒng)在保溫箱內(nèi)維持37。C放置3天。Ca溶液和PO4溶液初始PH分別為7.6和4.5.為了研究溶液PH在礦化過程中的影響，通過添加HCl和NaOH分別調(diào)節(jié)兩個溶液的PH值到7.4和9.0.在每一個礦化情況下測定纖維蛋白凝膠的PH了解礦化前后PH的變化。研究氟化物在礦化作用中的影響，2-2000ppm HF被加入到PO4溶液中。為了控制整個溶液系統(tǒng)的礦化作用，在37。C下25mL的Ca溶液

11、直接倒入25mL的PO4mL。</p><p><b>　　礦化產(chǎn)品的評價</b></p><p>　　礦化作用后，將凝膠系統(tǒng)在室溫下風(fēng)干24h，然后將獲得的產(chǎn)品用粉末X射線衍射分析法鑒定產(chǎn)品。（002）高度的一半值被認(rèn)為是制的的礦物的結(jié)晶度指數(shù)。</p><p>　　礦物的沉淀現(xiàn)象和晶體的形態(tài)用掃描電子顯微鏡觀察。對于掃描電子顯微鏡觀察時，在

12、以礦化的纖維蛋白凝膠中加入4%多聚甲醛，然后用磷酸鹽緩沖溶液洗滌六次后在加入1%的OsO4再用磷酸鹽緩沖溶液洗滌六次，最后用濃度達(dá)到100%de 乙醇進(jìn)行脫水。凝膠用CO2在臨界溫度干燥45分鐘</p><p>　　圖1 （A）示意圖凝膠擴(kuò)散系統(tǒng)：Ca2+和PO34-在凝膠系統(tǒng)中以相反的方向擴(kuò)散到纖維蛋白膠，以促進(jìn)凝膠礦化。（B）纖維蛋白凝膠的尺寸：8mm×3.4mm（直徑×厚度）：（a） 纖

13、維蛋白凝膠 （b）礦化4小時 （c） 礦化3天</p><p><b>　　溶解度的測定</b></p><p>　　為了評價制的的樣品的生物降解性，我們進(jìn)行了體外溶解度測定實(shí)驗(yàn)。樣品浸入到PH為4.8的濃度為0.1moL/L的10mL醋酸鹽緩沖溶液中，在37。C下保溫5天，剩下的樣品被完全溶解在10mL的HCl溶液中，每個溶液中Ca離子的濃度使用先前描述的一種方法

14、原子吸收的分光光度計測定。在凝膠中礦物的溶解度被定義為被洗提的 Ca 離子的含量與組成的凝膠中的初次的 Ca 含量的比值。</p><p><b>　　結(jié)果</b></p><p>　　體外纖維蛋白凝膠的礦化過程</p><p>　　礦化作用后，一個白色礦物沉淀（能帶）在纖維蛋白凝膠中被觀察了10 分鐘，然而在礦化凝膠系統(tǒng)溶液中，當(dāng)Ca溶液被滴

15、加到PO4溶液中立即就觀察到白色沉淀。最初，在纖維素凝膠的礦物沉淀被觀察了在Ca 溶液被倒的區(qū)域（C 邊）, 和能帶區(qū)域然后擴(kuò)大為這PO4 溶液被倒的區(qū)域 （P 邊）。最后，4小時后凝膠體全變白了。如圖1（B）</p><p>　　在礦化前凝膠的PH為6.61，在表一的條件下凝膠系統(tǒng)PH值在24小時后將會增加。</p><p><b>　　表一</b></p&g

16、t;<p>　　礦化24小時后纖維凝膠系統(tǒng)的PH值 </p><p>　　條件 PH值</p><p>　　礦化之前纖維凝膠 6.61 +_0.12</p><p>　　不受酸堿約束 5.14 + 0.15

17、</p><p>　　PH為 7.4 6.09 + 0.20</p><p>　　PH為 9.0 6.48 +0.24</p><p><b>　　礦化產(chǎn)品的評價</b></p><p>　　利用XRD分析可以了解在不

18、同PH條件下礦物性能。在礦化系統(tǒng)溶液在不受約束的酸堿質(zhì)條件之下獲得礦產(chǎn)品是二水磷酸氫鈣（DCPD），在PH為7.4時獲得的是 磷酸八鈣 （OCP）和羥基磷灰石（HAP）的混合物，在PH為9.0時，獲得的也是OCP和HAP的混合物。在凝膠系統(tǒng)中，在不受約束的酸堿質(zhì)條件之下獲得礦產(chǎn)品是二水磷酸氫鈣（DCPD），在PH為7.4時獲得的是 磷酸八鈣 （OCP）和二水磷酸氫鈣（DCPD）的混合物，在PH為9.0時，獲得的也是OCP和HAP的混合物

19、。如圖2.（A）觀察XRD的輪廓可知，在凝膠擴(kuò)散系統(tǒng)中礦物的結(jié)晶產(chǎn)物明顯高于在礦物溶液系統(tǒng)中產(chǎn)生的。</p><p>　　為了了解目前的氟離子對凝膠系統(tǒng)中對礦物產(chǎn)生的影響，因此，在不同的PH條件下分別向磷酸鹽溶液中加入200ppm的氫氟酸，然后使用XRD方法研究在纖維蛋白凝膠系統(tǒng)中礦物的生成量。結(jié)果顯示，在任何pH值下纖維蛋白凝膠系統(tǒng)中礦物的生成都為羥基磷灰石/氟磷灰石（FAP）的。此外，在每個樣本中樣品的結(jié)晶度

20、沒有明顯差異，如圖2（B)。為了進(jìn)一步研究成礦條件，我們選擇pH值7.4，這是因?yàn)檫@種條件與生物的環(huán)境條件相似。</p><p>　　在凝膠系統(tǒng)中，為了獲得礦物成分的不同程度的結(jié)晶和溶解度，我們向凝膠成礦系統(tǒng)中添加了不同濃度的氟離子（2—2000ppm)。XRD分析表明，在不加氟離子的情況下，所產(chǎn)生的礦物是DCPD和OCP的混合物，在氟離子濃度達(dá)到20 ppm時，產(chǎn)物是OCP和HAP的混合物，并在氟離子濃度達(dá)到5

21、00 ppm時，產(chǎn)物是典型的HAP/ FAP的混合物。最后，X射線衍射圖譜表明，在氟離子濃度超過500 ppm時，產(chǎn)生的礦物是HAP/ FAP的復(fù)合材料和氟化鈣（CaF2）的混合物，如圖3（A）。為了估計氟離子對礦物結(jié)晶的影響，結(jié)晶指數(shù)被認(rèn)定為在（002）峰逆寬度的半值。當(dāng)氟離子濃度達(dá)到100ppm時，結(jié)晶度明顯提高并且氟離子濃度高于100ppm時，其飽和（圖4）。當(dāng)氟離子濃度從0到500ppm變化時，（300）反射峰位置轉(zhuǎn)移到更高的角

22、度，表明在礦物中FAP的成分也隨著氟離子濃度增加而增加圖3（B）。</p><p>　　為了了解在纖維凝膠系統(tǒng)中晶體的生長過程，在20 ppm的氟離子條件下獲得了不同的時間點(diǎn)的以礦化的凝膠系統(tǒng)的掃描電鏡圖像。結(jié)果表明，在纖維蛋白凝膠系統(tǒng)中礦物發(fā)生礦化的一分鐘后就會發(fā)生核化，以及隨著時間，礦物晶體顆粒生長和轉(zhuǎn)化為針狀結(jié)構(gòu)（圖5）。為了鑒別氟離子對晶體形態(tài)的影響，在加入不同濃度氟離子后，經(jīng)過三天的礦化我們獲得晶體的掃

23、描顯微圖像。隨著氟離子濃度的增加，可發(fā)現(xiàn)彩帶般的OCP的晶體數(shù)量減少。最后，當(dāng)氟離子濃度200 ppm時，針狀晶體FAP覆蓋整個晶區(qū)，如圖6</p><p><b>　　溶解度實(shí)驗(yàn)</b></p><p>　　每個樣品的溶解度被定義為在礦化凝膠系統(tǒng)中鈣離子被洗脫的含量與最初的鈣含量的比值。和預(yù)期一樣，溶解度隨氟離子濃度增加而增加。（圖4）</p><

24、;p>　　圖二， (A)在不同的PH下，凝膠擴(kuò)散和溶液系統(tǒng)中產(chǎn)生的礦物X射線衍射圖；（A至C）在溶液系統(tǒng)中礦物：（a）不受酸堿約束條件 ；（b）PH=7.4；（c）PH=9.0；（d到f）在凝膠系統(tǒng)中礦物：（d）不受酸堿約束條件 ；（e）PH=7.4；（f）PH=9.0；</p><p>　　（B）在氟離子量為200ppm時，在不同的PH下，凝膠擴(kuò)散系統(tǒng)中產(chǎn)生的礦物的X射線衍射圖：（a）不受酸堿約束條件 ；

25、（b）PH=7.4；（c）PH=9.0。</p><p>　　圖3 (A) 在pH值為7.4時，不同氟化物濃度所獲得礦物的X射線衍射圖（B）礦化產(chǎn)品的（300）X射線反射圖：（a） 沒有氟離子 （b）氟離子濃度2ppm （c）（d）20ppm（e）50ppm（f）200ppm（g）500ppm（h）1000ppm（i）2000ppm。</p><p>　　圖4.當(dāng)pH7.4 氟化物濃度

26、不同時，在纖維蛋白膠中所獲得的礦物的結(jié)晶度（■）和溶解度（●）。結(jié)晶度定義為在（002）峰逆半值寬度，在凝膠的礦物質(zhì)溶解度定義為在復(fù)合凝膠中鈣離子的洗脫的含量比最初的鈣含量。</p><p><b>　　討論</b></p><p>　　在過去的幾十年中，為了改善有機(jī)/無機(jī)復(fù)合材料的機(jī)械性能，生物降解性，生物相容性，許多研究已經(jīng)開始進(jìn)行了。本次研究中，我們建立了一個

27、制備有機(jī)/無機(jī)纖維蛋白的方法：通過使用鈣溶液和PO4溶液雙向擴(kuò)散方式制成纖維蛋白膠。我們也證明了這種復(fù)合材料的礦物相的特征可通過改變pH值和氟離子的濃度而控制。 首先，我們比較了在凝膠擴(kuò)散系統(tǒng)和溶液系統(tǒng)中形成的礦物特征。在凝膠擴(kuò)散系統(tǒng)中生成的礦物的結(jié)晶度比在溶液中生成系統(tǒng)中較高。纖維蛋白膠是由一個個小纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)組成的，在凝膠系統(tǒng)中這種結(jié)構(gòu)可能減輕離子擴(kuò)散速率和促進(jìn)晶體增長。在不含氟離子的情況下，在凝膠擴(kuò)散系統(tǒng)中，當(dāng)不受酸堿約束

28、下獲得的礦物是DCPD；當(dāng)PH是7.4時，獲得的礦物是DCPD和OCP的混合物；當(dāng)PH是9.0時，獲得的礦物是OPD和HAP的混合物。以前的報告表明DCPD合成的最適當(dāng)?shù)膒H值條件是酸性的，對于OCP，它是中性偏弱酸性，對于HAP，它是中性偏弱堿性。在礦化期間，凝膠系統(tǒng)的pH值下降可能是由于目前產(chǎn)生的結(jié)果造成的。</p><p>　　雖然當(dāng)PH為9.0時，在礦化中可以獲得羥基磷灰石類礦物，但是獲得的礦物的結(jié)晶度仍

29、然很低。為了控制生成的礦物結(jié)晶度，我們研究了在凝膠系統(tǒng)中氟離子對礦化作用的影響。有趣的是，當(dāng)氟離子濃度為200 ppm時，無論P(yáng)H值為多少，X射線衍射輪廓表明HAP/ FAP的類均具有高的結(jié)晶度。這一結(jié)果表明，氟離子可促進(jìn)磷灰石晶體的穩(wěn)定性和抑制以形成的晶體的變形和水化。</p><p>　　由于在生物硬組織中氟離子的濃度較高，而且在牙釉質(zhì)形成期階段氟離子的吸收量也是最高的。我們的結(jié)果也證實(shí)了猜想：在生物礦化過程

30、中，增強(qiáng)羥基磷灰石生物礦化的結(jié)晶度，氟化物含量是一個關(guān)鍵因素。然后，我們研究了在凝膠系統(tǒng)中氟離子濃度對礦物形成的影響。隨著氟離子濃度從2-500的增加，凝膠系統(tǒng)中礦物特征也在改變，從在OCP/HAP復(fù)合材料到HAP/ FAP復(fù)合材料。隨后，當(dāng)氟離子的濃度超過500ppm時，凝膠系統(tǒng)中將會形成氟化鈣。在有機(jī)/無機(jī)復(fù)合材料中控制無機(jī)相的結(jié)晶度和溶解度將有利于其降解調(diào)控，因?yàn)槔w維蛋白膠具有生物降解性能。為了了解這種復(fù)合材料的結(jié)晶度和溶解度之間

31、的關(guān)系，我們研究了當(dāng)氟離子的濃度（0-200 ppm）變化時，該材料不同的礦物形成的溶解度。所獲得的礦物結(jié)晶度隨著氟離子濃度的增加而提高，以及溶解度表現(xiàn)出與結(jié)晶度負(fù)相關(guān)的關(guān)系。</p><p>　　在骨組織再生過程中，最</p><p>　　重要的是要控制新植入骨組織的生物降解性材料的生物降解性。我們建立了一種新的仿生材料制備方法，纖維蛋白和鈣磷酸鹽復(fù)合。并顯示礦物的特征和結(jié)晶度可以有制備

32、條件控制。這種有機(jī)/無機(jī)材料在礦化過程中多樣的特征將有助于理想的骨組織再生過程控制其生物降解性以配合適的治療。</p><p>　　圖5，在pH7.4，氟化物濃度為20 ppm時，晶體生長的掃描電鏡圖像，（A）纖維蛋白凝膠；B）1分鐘礦化后；（C）30分鐘礦化后；（D）6小時礦化后。</p><p>　　圖6，在pH7.4，氟化物濃度為不同時礦物晶體的掃描電鏡圖像：（A）0ppm，（B