刺參(Apostichopus japonicus Selenka)對(duì)典型環(huán)境脅迫的生理生態(tài)學(xué)響應(yīng)及其機(jī)制研究.pdf

1、刺參(Apostichopus japonicus Selenka)屬于棘皮動(dòng)物門(Echinodermata)、海參綱(Holothroidea)，是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)種類。近年來(lái)，由于其較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，刺參養(yǎng)殖業(yè)在我國(guó)發(fā)展很快，目前已成為海水養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè)之一。本論文以刺參為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)了典型的環(huán)境脅迫因子，包括溫度、氨氮、饑餓和夏眠、運(yùn)輸、排臟等，對(duì)比研究了脅迫種類、脅迫強(qiáng)度、脅迫作用方式等對(duì)刺參生理和生態(tài)學(xué)的不同影響。通過(guò)

2、本研究的進(jìn)行，不僅可以揭示環(huán)境脅迫對(duì)刺參影響的生理和生態(tài)學(xué)機(jī)制，豐富刺參生物學(xué)研究?jī)?nèi)容，還有助于找到消除或緩解環(huán)境脅迫對(duì)刺參負(fù)面影響的方法，從而為改進(jìn)刺參養(yǎng)殖技術(shù)、促進(jìn)刺參養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供必要的理論依據(jù)，因此具有重要的理論和實(shí)際意義。研究結(jié)果總結(jié)如下：
　　 1.采用實(shí)驗(yàn)生態(tài)學(xué)的方法，研究了不同變溫模式(變溫回復(fù)、變溫維持)、變溫強(qiáng)度(16±4℃，±8℃，±12℃)及變溫方向(升溫、降溫)對(duì)刺參(Apostichopusja

3、ponicus Selenka)幼參(體重3.37-4.61g)熱休克蛋白70(Hsp70)表達(dá)的影響。主要結(jié)果如下：(1)升溫組在不同變溫模式下刺參熱休克蛋白70表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)開始后均迅速升高，說(shuō)明溫度脅迫可以迅速誘導(dǎo)熱休克蛋白70的表達(dá)(P<0.05)。(2)在升溫回復(fù)實(shí)驗(yàn)中，溫度可以誘導(dǎo)熱休克蛋白70的迅速表達(dá)(P<0.05)，當(dāng)放回正常溫度時(shí)，熱休克蛋白70水平逐漸下降，下降趨勢(shì)一直保持到72h，其中R24組在第72h與對(duì)照組無(wú)顯

4、著差異(P>0.05)，R20組在第48h與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，這說(shuō)明熱應(yīng)激后熱休克蛋白70表達(dá)迅速但維持時(shí)間較短。(3)升溫維持組刺參熱休克蛋白70表達(dá)在實(shí)驗(yàn)開始后迅速升高，之后緩慢降低但始終維持在一個(gè)較高的水平上，說(shuō)明持續(xù)的熱應(yīng)激可以誘導(dǎo)熱休克蛋白70持續(xù)表達(dá)。(4)刺參熱休克蛋白70的誘導(dǎo)強(qiáng)度不僅與變溫持續(xù)時(shí)間有關(guān)，并且也與變溫強(qiáng)度相關(guān)聯(lián)。在本實(shí)驗(yàn)中，升溫組變溫幅度越大，刺參熱休克蛋白70的表達(dá)越迅速，表達(dá)強(qiáng)度越高，

5、維持時(shí)間越長(zhǎng)。(5)本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，升溫組刺參熱休克蛋白表達(dá)在應(yīng)激開始后2h迅速升高，但是降溫組刺參熱休克蛋白表達(dá)在應(yīng)激開始后4h內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定，然后迅速升高至第8h達(dá)到最高。刺參熱休克蛋白70的表達(dá)對(duì)不同變溫方向的相應(yīng)不同，相比降溫波動(dòng)，刺參對(duì)升溫波動(dòng)更加敏感。綜上，更多的研究應(yīng)當(dāng)以此為基礎(chǔ)，關(guān)注于更復(fù)雜的、貼近自然狀態(tài)的熱應(yīng)激條件下刺參熱休克蛋白表達(dá)的規(guī)律和分子機(jī)制。
　　 2.以初始體重為(50.50±1.67)g左右的刺

6、參(Apostichopusjaponicus Selenka)為研究對(duì)象，研究了不同氨氮濃度對(duì)刺參體壁和體腔液中酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性及Hsp70表達(dá)的影響。20天慢性毒性實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明：(1)刺參體壁和體腔液ACP、AKP活性在0.51和2.04 mg/L氨氮濃度下表現(xiàn)出先上升后降低的趨勢(shì)，而在5.09、10.19和50.93mg/L下，則表現(xiàn)出降低的趨勢(shì)；(

7、2)不同濃度氨氮脅迫下，刺參體壁CAT活性均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，且與氨氮濃度呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，而刺參體腔液CAT活性在0.51、5.09、10.19和50.93 mg/L濃度下則均隨取樣時(shí)間而降低；(3)在氨氮濃度0.51～5.09 mg/L時(shí)，刺參體壁和體腔液SOD活性均表現(xiàn)出不同程度的先增高后降低的趨勢(shì)，而在高濃度下則與氮氮濃度顯著負(fù)相關(guān)；(4)在氨氮脅迫下，刺參體壁、呼吸樹、腸道和體腔液中Hsp70表達(dá)量迅速升高，氨氮

8、脅迫第5天時(shí)檢測(cè)到達(dá)到最高；隨后各組織Hsp70的表達(dá)量緩慢降低，但在氨氮脅迫第20天時(shí)，各組織Hsp70的表達(dá)量仍顯著高于氨氮脅迫前的水平(P<0.05)。各組織中Hsp70最高表達(dá)量與氨氮濃度呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)性。綜合本研究結(jié)果可以看出，隨著氨氮脅迫濃度的增加和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，刺參免疫酶活性趨于降低，同時(shí)機(jī)體清除自由基的能力下降，機(jī)體非特異性免疫防御系統(tǒng)遭到損傷。而Hsp70表達(dá)量維持在較高水平，對(duì)于增強(qiáng)機(jī)體的抗逆性具有重要的作用。<

9、br>　　 3.采用實(shí)驗(yàn)生態(tài)學(xué)方法，研究了刺參(Apostichopus japonicus Selenka)在夏眠、實(shí)驗(yàn)性夏眠、饑餓狀態(tài)下生長(zhǎng)、代謝及免疫應(yīng)答的變化。通過(guò)測(cè)定刺參體重、耗氧率(OCR)、體壁和體腔液中免疫酶活性包括酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性以及熱休克蛋白70(Hsp70)表達(dá)，以評(píng)估刺參在不同處理下的生理反應(yīng)。主要結(jié)果如下：(1)在所有三個(gè)處理中刺參

10、體重顯著下降(P<0.05)。(2)饑餓組、實(shí)驗(yàn)性夏眠組刺參OCR下降，但自然夏眠組刺參COR逐漸升高。(3)三個(gè)處理組體壁和體腔液中ACP、AKP活性逐漸降低，饑餓組和實(shí)驗(yàn)性夏眠組刺參體壁和體腔液中SOD、CAT活性及Hsp70表達(dá)逐漸降低，但是自然夏眠組刺參體壁和體腔液中SOD、CAT活性及Hsp70表達(dá)逐漸升高。結(jié)果顯示，刺參在饑餓條件下，體重、代謝速率及免疫應(yīng)答由于停止攝食而降低。當(dāng)水溫保持在24℃時(shí)，刺參進(jìn)入夏眠狀態(tài)，但是實(shí)驗(yàn)

11、性夏眠與自然夏眠狀態(tài)在耗氧率、免疫應(yīng)答及Hsp70表達(dá)方面不盡相同。這揭示了夏眠的機(jī)制是復(fù)雜的，不能僅僅歸咎于環(huán)境因子的變化，比如溫度。
　　 4.采用實(shí)驗(yàn)生態(tài)學(xué)的方法，研究了帶水運(yùn)輸法不同運(yùn)輸溫度(10℃、15℃、20℃、)、密度和運(yùn)輸時(shí)間(<24h)對(duì)刺參(Apostichopus japonicus Selenka)幼參行為、排臟及存活的影響，并在此基礎(chǔ)上確定不同溫度下刺參幼參運(yùn)輸?shù)呐R界密度以研究不同溫度、密度和運(yùn)輸時(shí)間對(duì)

12、刺參機(jī)體生理指標(biāo)的影響以及機(jī)體對(duì)運(yùn)輸過(guò)程中脅迫因子的響應(yīng)機(jī)制。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)輸作為一種多因子協(xié)同作用的急性脅迫過(guò)程，運(yùn)輸密度、運(yùn)輸溫度及運(yùn)輸時(shí)間對(duì)刺參的行為、存活及生理指標(biāo)均具有顯著地影響。采用塑料袋加水充氧的方法以較高的密度運(yùn)輸刺參稚參是可行的。保持較低溫度(10℃)可以提高刺參的運(yùn)輸密度(140頭/2kg水)，并可以延長(zhǎng)運(yùn)輸時(shí)間(24h)，但較低的溫度、較高的密度及較長(zhǎng)的運(yùn)輸時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)刺參休克后恢復(fù)的時(shí)間。因而，在10℃下保持14

13、0頭/2kg水的密度運(yùn)輸24h是可行的，但我們建議刺參的運(yùn)輸采用更加保守的范圍，降低脅迫強(qiáng)度以利于釋放后更快的恢復(fù)。
　　 5.于2009年5月17日到2009年6月30日，采用實(shí)驗(yàn)生態(tài)學(xué)的方法，研究了人工誘導(dǎo)排臟對(duì)刺參(Apostichopusjaponicus Selenka)生長(zhǎng)、代謝及免疫應(yīng)答的影響。通過(guò)測(cè)定體重、特定生長(zhǎng)率(SGR)、耗氧率(OCR)及體壁、腸道、呼吸樹中免疫酶活力，包括酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶

14、(AKP)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)、微量丙二醛(MDA)以評(píng)估刺參排臟及內(nèi)臟再生過(guò)程中的生理反應(yīng)。結(jié)果顯示，排臟后刺參體重顯著下降然后隨著消化功能的恢復(fù)逐漸上升，然而排臟45天后末體重始終極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)第10天至第20天再生組SGR上升而在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。刺參排臟后OCR迅速降低隨后逐漸升高并在第45天與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.0

15、5)。刺參再生期間的免疫應(yīng)答具有明顯的組織特異性。排臟后體壁內(nèi)ACP和AKP活力升高，于第10天達(dá)到峰值然后逐漸降低并于第45天降至正常水平(P>0.05)。20天后再生組織中ACP和AKP活力存在不同的上升趨勢(shì)，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)呼吸樹中ACP活力、腸道和呼吸樹AKP活力恢復(fù)正常水平(P>0.05)，而腸道ACP活力仍然顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。體壁SOD活力受排臟影響不大而再生組織中SOD活力顯著升高并于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)極顯著高于對(duì)照組(

16、P<0.01)。體壁CAT活力升高并于20天達(dá)到峰值且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中始終顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，呼吸樹中CAT活力持續(xù)升高并在第45天與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，而腸道中CAT活力受排臟影響不大(P>0.05)。排臟后三種組織中T-AOC和MDA均顯著升高(P<0.05)，但在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)均恢復(fù)正常水平(P>0.05)。本研究說(shuō)明排臟對(duì)刺參生長(zhǎng)、代謝以及免疫應(yīng)答均具有顯著的影響。盡管再生組體重與對(duì)照組具有顯著差異，但SGR、