油菜種子貯藏物質(zhì)合成及外源激素調(diào)控的生化分析.pdf

1、油菜作為我國(guó)重要的油料作物，是食用油和飼料蛋白的重要來(lái)源，怎樣提高油菜籽產(chǎn)量及含油量一直都是油菜育種的研究重點(diǎn)。盡管植物貯藏物質(zhì)合成的主要途徑已經(jīng)被研究得比較清楚，但是該途徑受到外界環(huán)境和內(nèi)部因素調(diào)控的分子機(jī)理不太明晰，因此從基因表達(dá)調(diào)控的角度來(lái)探索植物貯藏物質(zhì)合成途徑的調(diào)控機(jī)制的研究就顯得很有必要。本論文分析了43個(gè)擬南芥貯藏物質(zhì)合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子序列，檢測(cè)了油菜的主要種子轉(zhuǎn)錄因子和貯藏物質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)特性，研究了外源赤霉素（

2、GA）和脫落酸（ABA）對(duì)油菜籽貯藏物質(zhì)積累的影響及其相關(guān)基因表達(dá)的影響，篩選到了可能響應(yīng)脫落酸或赤霉素并調(diào)控貯藏物質(zhì)合成的bZIP轉(zhuǎn)錄因子。論文的具體研究結(jié)果如下：
　?。?）系統(tǒng)分析了35個(gè)油脂合成關(guān)鍵酶基因和8個(gè)貯藏蛋白的編碼基因的啟動(dòng)子序列，發(fā)現(xiàn)共有246種順式元件出現(xiàn)在上述序列中，其中出現(xiàn)頻率大于70％的順式元件共有67種。其中，與脫落酸、赤霉素等植物激素信號(hào)途徑相關(guān)的順式元件有15種，與脅迫相關(guān)的有14種，與光調(diào)節(jié)相關(guān)

3、的順式元件有12種，與糖代謝相關(guān)的順式元件5種。以上分析結(jié)果暗示，植物油脂及貯藏蛋白的合成除受環(huán)境因素的影響外，還受到了植物內(nèi)源激素的調(diào)控。
　?。?）采用半定量RT-PCR分析了20個(gè)貯藏物質(zhì)相關(guān)基因和6個(gè)主要種子轉(zhuǎn)錄因子基因在甘藍(lán)型油菜不同組織器官中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在果莢中有大量表達(dá)的貯藏物質(zhì)相關(guān)基因（16/20）最多，在葉片、花蕾和花朵中有表達(dá)的次之（12/20），在莖和根中有表達(dá)較少（3/20）。而6個(gè)主要種子轉(zhuǎn)錄因子基因

4、都集中在果莢中大量表達(dá)。隨后，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR（Q-PCR）進(jìn)一步分析了上述基因在果莢各發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子LEC1、LEC2和WRI以及多數(shù)的貯藏物質(zhì)相關(guān)基因（15/20）的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高，隨后下降，至25 DAF（Days After Flowering）達(dá)到的最低，然后再升高的模式；轉(zhuǎn)錄因子FUS3、ABI3和ABI5的表達(dá)量則隨油菜果莢發(fā)育而持續(xù)增加到后期；貯藏蛋白基因Napin和Cruciferin在20 D

5、AF時(shí)才有明顯表達(dá)，之后分別在25 DAF和30 DAF出現(xiàn)表達(dá)高峰。同時(shí)，檢測(cè)了不同成熟時(shí)期油菜籽的總蛋白和粗脂肪含量，發(fā)現(xiàn)蛋白與油脂都隨著種子的成熟而持續(xù)增加，但二者在25DAF后的增加速度發(fā)生了對(duì)調(diào)。以上結(jié)果表明，25DAF是油菜籽發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點(diǎn)，其可能的原因是由于主要種子轉(zhuǎn)錄因子在25DAF前后的表達(dá)變化引起了貯藏物質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)變化，從而導(dǎo)致了油菜籽總蛋白和粗脂肪含量變化。
　　（3）采用100 mM赤霉素G

6、A3在油菜籽成熟前（15 DAF）、中（25 DAF）、后（35 DAF）期分別處理甘藍(lán)型油菜W6的果莢，發(fā)現(xiàn)3個(gè)時(shí)期的處理均能增加油菜籽的總糖含量和硫苷含量，而對(duì)油菜籽的含油量影響不明顯。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，前期和中期GA3處理都能降低總蛋白含量，但后期處理則提高其含量，而油菜籽重量基本不受前期GA3處理的影響，卻在中期和后期GA3處理后降低。另外，通過(guò)對(duì)油脂合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，油脂合成限速酶基因DGAT的表達(dá)量在前期處理中增加了1

7、倍以上，而在中期和后期處理中則沒(méi)有明顯變化，該結(jié)果與油菜籽含油量的變化一致。以上結(jié)果說(shuō)明，在油菜籽成熟期間施用赤霉素對(duì)油菜籽產(chǎn)量、品質(zhì)及含油量都可能會(huì)造成不利影響。
　?。?）采用10μM的脫落酸在油菜籽成熟的前、中、后期分別處理甘藍(lán)型油菜W6和湘雜油3號(hào)的果莢，發(fā)現(xiàn)3個(gè)時(shí)期的處理都能夠增加油菜籽的重量和含油量，降低菜籽油中超長(zhǎng)鏈脂肪酸含量。而對(duì)油菜籽的粗蛋白、總糖及硫苷含量的影響則兩個(gè)品種中存在不同。另外，通過(guò)對(duì)油脂合成相關(guān)基因

8、轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，脫落酸處理能夠長(zhǎng)期地（5天或更長(zhǎng)）促進(jìn)基因DGAT的表達(dá)量增加，其表達(dá)量變化與油菜籽含油量變化一致。該研究結(jié)果表明，在油菜籽成熟期間進(jìn)行脫落酸處理不但能顯著增加油菜籽產(chǎn)量及含油量還能改善菜籽油的品質(zhì)，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)具有相當(dāng)重要的指導(dǎo)意義。
　?。?）通過(guò)基因芯片數(shù)據(jù)分析和Q-PCR鑒定，篩選得到了在種子中大量表達(dá)并可能響應(yīng)脫落酸或赤霉素的3個(gè)功能未知的BnbZIP基因，并分別將其過(guò)量表達(dá)于擬南芥中。隨后對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南

9、芥的表型分析發(fā)現(xiàn)，BnbZIP12過(guò)量表達(dá)株系的生長(zhǎng)受到抑制，BnbZIP43過(guò)量表達(dá)株系的結(jié)實(shí)率顯著降低，而B(niǎo)nbZIP66過(guò)量表達(dá)株系的種子重量增加且貯藏物質(zhì)比例改變明顯。據(jù)此我們推測(cè)bZIP12參與了植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的調(diào)控，bZIP43參與了配子產(chǎn)生或受精過(guò)程的調(diào)控，bZIP66則參與了種子貯藏物質(zhì)合成的調(diào)控。
　　綜上所述，本研究為油菜的育種研究和實(shí)際生產(chǎn)提供了有益參考，也為探索種子貯藏物質(zhì)合成表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子