太平洋鱈發(fā)育早期免疫系統(tǒng)相關(guān)基因的克隆分析及表達(dá)規(guī)律的研究.pdf

1、太平洋鱈（Gadus macrocephalus）是我國北方海域重要的經(jīng)濟(jì)魚類。近年來，由于捕撈量劇增，導(dǎo)致其野生資源不斷下降。本實(shí)驗(yàn)室的太平洋鱈人工繁育技術(shù)不斷取得突破，但在育苗早期過程中仍會出現(xiàn)仔稚魚突發(fā)性大量死亡現(xiàn)象。為解決這一瓶頸，本實(shí)驗(yàn)從太平洋鱈自身免疫系統(tǒng)出發(fā)，通過RAG1、IgM和ISG15基因的轉(zhuǎn)錄水平來衡量太平洋鱈免疫系統(tǒng)的早期發(fā)育特點(diǎn)，以期為人工育苗早期階段有針對性的做好疾病防疫工作提供理論依據(jù)。
　　首先，根

2、據(jù)已報(bào)道的其它硬骨魚類的RAG1、IgM和ISG15基因序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)兼并引物，以太平洋鱈幼魚的胸腺和頭腎為實(shí)驗(yàn)材料，經(jīng)過基因克隆測序，獲得目的基因片段。為研究太平洋鱈發(fā)育早期免疫系統(tǒng)形成的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)建立了絕對熒光定量PCR檢測方法，分別對目的基因在太平洋鱈各組織以及發(fā)育早期階段中的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。另外，利用Western Blot技術(shù)從蛋白水平對RAG1在組織中的表達(dá)差異進(jìn)行了分析。實(shí)驗(yàn)得出結(jié)果如下：
　　太平洋鱈RAG

3、1基因cDNA序列長3755 bp，包括一個1854 bp的ORF，可編碼617個氨基酸殘基，預(yù)測其分子量為69 kDa，GenBank序列號為KM408434。太平洋鱈RAG1氨基酸序列與其它魚類RAG1氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，其同源性高達(dá)85％以上。通過熒光定量PCR檢測太平洋鱈各組織中RAG1的表達(dá)水平結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程以及回歸系數(shù)為：y=-3.2662x+33.772，R2=0.9961；RAG1只在胸腺和頭腎兩個器官中有

4、表達(dá)，未在肝、脾、鰓、腸以及性腺組織檢測到信號，其中在胸腺中的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于頭腎，而幼魚胸腺中的表達(dá)水平高于成魚胸腺。Western Blot結(jié)果從蛋白水平驗(yàn)證了RAG1在胸腺中的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于頭腎。說明太平洋鱈的胸腺是發(fā)育早期主要的免疫器官，是RAG1基因表達(dá)的主要組織。另外，Western Blot顯示出的蛋白條帶分子量為69 kDa，從蛋白水平對克隆得到的RAG1序列的準(zhǔn)確性加以驗(yàn)證。
　　太平洋鱈IgM重鏈基因cDNA序列

5、全長1862 bp，包括一個1713 bp的ORF，可編碼570個氨基酸殘基，預(yù)測分子量為63 kDa，Genbank序列號為KM408433。分析氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，該序列與其它已報(bào)道魚類的序列有高度的同源性。結(jié)構(gòu)上包括一個信號肽（Signal peptide）、一個可變區(qū)（VH）、4個固定區(qū)（CH）和一個鉸鏈區(qū)（Hinge），其中可變區(qū)包括了4個骨架區(qū)（FR）和3個互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）。該IgM屬于分泌型免疫球蛋白。熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲

6、線回歸方程和回歸系數(shù)為：y=-3.249x+32.27，R2=0.998；結(jié)果顯示，IgM在胸腺、頭腎、肝、脾、鰓、腸以及性腺中均有表達(dá)，其中幼魚時期的脾臟中表達(dá)水平最高，其次是頭腎，而成魚在頭腎中的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于其它組織。
　　克隆得到太平洋鱈ISG15基因cDNA序列長444 bp，可編碼85個氨基酸殘基。經(jīng)核酸序列對比發(fā)現(xiàn)，該序列只與已報(bào)道的3種類型大西洋鱈ISG15序列有同源性，其中最高同源性達(dá)90%。熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲

7、線回歸方程及回歸系數(shù)為：y=-3.158x+33.85，R2=0.998，其組織差異表達(dá)結(jié)果顯示，ISG15在胸腺、頭腎、肝、脾、鰓、腸以及性腺中均有表達(dá)，其中幼魚在脾中表達(dá)水平最高，而成魚的鰓中最高。另外從整體來看，幼魚體內(nèi)各組織中ISG15的表達(dá)水平要高于成魚。
　　實(shí)驗(yàn)跟蹤采集受精卵時期到95 dph期間的太平洋鱈仔稚魚，以分析發(fā)育早期階段魚體內(nèi)RAG1、IgM和ISG15的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果顯示，RAG1和IgM均在61 dp