靈芝三萜酸、喜樹堿、人參皂苷合成及調(diào)控基因的篩選、克隆和功能分析.pdf

1、我國藥用植物種類繁多，但大多數(shù)藥用植物遺傳背景復(fù)雜，轉(zhuǎn)錄組和基因組信息匱乏，藥效成分合成相關(guān)酶基因的研究較為有限。基因序列和信息的缺乏成為藥用植物在分子生物學(xué)方面進(jìn)行深入研究的瓶頸。表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)技術(shù)與新一代測序技術(shù)的結(jié)合，為藥用植物的藥效成分合成相關(guān)酶基因的深入研究提供了很好的契機(jī)。通過對(duì)藥用植物轉(zhuǎn)錄組測序，獲得EST序列并對(duì)這些序列進(jìn)一步發(fā)掘和篩選，得到藥用植物藥效成分合成的關(guān)鍵酶基因的候選序列。本文運(yùn)用高通量測序技術(shù)對(duì)喜樹

2、(Camptotheca acuminata)、赤芝(Ganoderma lucidum)和西洋參(Panax quinquefolius)這三種重要藥用植物的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了研究，并對(duì)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行了深入分析，獲得大量藥效成分合成的關(guān)鍵酶基因的候選序列和調(diào)控基因序列，為喜樹堿、靈芝酸和人參皂苷的生物合成研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 喜樹為珙桐科（藍(lán)果樹科）藥用植物，為我國南方特有物種，是抗腫瘤、抗病毒藥物喜樹堿的主要來源。本研究應(yīng)用第二

3、代454 GS FLX Titanium高通量測序平臺(tái)對(duì)喜樹幼葉的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，分析和篩選參與喜樹堿合成代謝途徑中的酶基因。主要取得以下結(jié)果：1)通過測序獲得74858條高質(zhì)量的EST，利用GS De novo軟件組裝得到30358個(gè)Unigene。通過與公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析，獲得21213條序列的注釋信息；2）獲得喜樹堿骨架異胡豆苷合成基因20個(gè)（共計(jì)521條EST序列），其中13個(gè)基因之前尚未報(bào)道，包括重要的香葉醇合成酶、

4、馬錢子苷合成酶和異胡豆苷合成酶基因；通過運(yùn)用RACE-PCR和RT-PCR技術(shù)，對(duì)這三種酶基因進(jìn)行了克隆和表達(dá)分析。結(jié)果表明，這三個(gè)基因在幼葉和葉柄中具有較高的表達(dá)水平并受茉莉酸甲酯(MeJA)和干旱脅迫誘導(dǎo)。細(xì)胞色素P450(CYP450)和糖基水解酶可能參與喜樹堿的合成。通過篩選和表達(dá)分析，獲得了7條CYP450和1條葡萄糖苷酶序列可能參與喜樹堿下游支鏈合成。3）此外，還獲得21條多藥耐藥基因(MDR)序列，組織表達(dá)分析后篩選到3條

5、可能參與喜樹堿轉(zhuǎn)運(yùn)的轉(zhuǎn)運(yùn)體基因序列。
　　 赤芝是擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌，具有增強(qiáng)免疫和抗疲勞的功效，其子實(shí)體中含多種靈芝酸，靈芝酸是靈芝主要藥效成分之一。本實(shí)驗(yàn)利用第二代454 GSFLX Titanium高通量測序平臺(tái)對(duì)赤芝的子實(shí)體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得479,579條reads序列，對(duì)其中419，158條序列進(jìn)行拼接后獲得41，068個(gè)Unigene，22,381條序列具有注釋結(jié)果。通過BLAST分析，從赤芝子實(shí)體數(shù)據(jù)

6、庫中找到23條參與羊毛甾醇合成的基因序列。此外，還在Swissprot數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果中搜索到可能參與靈芝酸下游氧化反應(yīng)的CYP450基因序列171條，篩選后獲得候選CYP450基因序列112條。靈芝為白腐菌，可以降解利用環(huán)境中的木質(zhì)素，通過Swissprot庫注釋結(jié)果和BLAST搜索，共發(fā)現(xiàn)6條可能參與木質(zhì)素降解的序列。這些序列為靈芝酸生物合成研究和木質(zhì)素降解研究提供了候選的基因資源。
　　 西洋參為多年生草本藥用植物，隸屬五

7、加科人參屬，其參根產(chǎn)生的三萜皂苷具有良好的增強(qiáng)免疫和抗腫瘤療效。本文通過對(duì)西洋參的高通量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的轉(zhuǎn)錄因子基因分析，篩選了可能參與調(diào)控三萜皂苷合成的轉(zhuǎn)錄因子基因。通過對(duì)四個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(Nr，Nt，Swissprot，Kegg)比較和關(guān)鍵詞搜索，找到936條注釋到轉(zhuǎn)錄因子的基因。將這些序列與植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫比對(duì)，發(fā)現(xiàn)753條序列可被注釋，歸為48個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，其中包括WRKY家族的45條序列。通過MeJA處理，本文篩選到一個(gè)明顯受

8、MeJA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄本片段，并對(duì)該轉(zhuǎn)錄本編碼的基因?qū)ζ溥M(jìn)行了克隆，命名為PqWRKY1。通過將該基因異源轉(zhuǎn)化擬南芥，表明Pq WRKY1在擬南芥中的表達(dá)可以提高擬南芥中三萜物質(zhì)合成基因的表達(dá)，并且提高了其對(duì)鹽和干旱脅迫的耐受能力。這表明此基因在西洋參中可能參與三萜皂苷的合成和對(duì)環(huán)境脅迫的抗性。
　　 綜上所述，本文借助新一代的高通量測序平臺(tái)對(duì)喜樹和赤芝的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，獲得了大量的ESTs，利用注釋結(jié)果篩選到大量參與喜樹