雙歧桿菌防止腸外營養(yǎng)所致肝損害實驗研究.pdf

1、目的：長期腸外營養(yǎng)會導(dǎo)致患者肝損害，但機制尚不明確。近來研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌具有肝臟保護作用。本研究通過建立腸外營養(yǎng)(PN)幼兔肝損害動物模型，研究其肝損害特點和可能機制，并通過給PN幼兔添加雙歧桿菌，探討其是否具有肝臟保護作用。 材料與方法：生后2周的新西蘭種白兔(體重200-250g)分為對照組、PN組和PN+雙歧桿菌組。對照組幼兔母乳喂養(yǎng)，PN組幼兔每日經(jīng)頸靜脈插管連續(xù)24h輸入營養(yǎng)液(210kca：l／kg／d)；PN+雙

2、歧組幼兔在輸入和PN組等熱量營養(yǎng)液同時，每日經(jīng)胃管給予青春雙歧桿菌活菌0.5x10<'8>PN幼兔第9d口服乳果糖和甘露醇溶液2ml(含乳果糖100mg，甘露醇50mg)，收集24h尿液。PN第10d，自幼兔糞便中提取全部DNA，合成雙歧桿菌和乳桿菌屬特異性探針，應(yīng)用SBYR GREEN I實時熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)對幼兔糞便進行雙歧桿菌和乳桿菌定量測定。作回腸組織病理和電鏡切片，觀察顯微和超微結(jié)構(gòu)變化，并作回

3、腸粘膜顯微測量；采用偶氮基質(zhì)顯色鱟試驗定量法測定血漿內(nèi)毒素水平；作內(nèi)臟組織(腸系膜淋巴結(jié)、脾、肺)勻漿和血培養(yǎng)觀察細(xì)菌移位并計算細(xì)菌移位率；應(yīng)用高效液相色譜(HPLC)技術(shù)檢測幼兔尿中乳果糖和甘露醇含量，計算乳果糖、甘露醇排出率比值(L／M)。取幼兔靜脈血測定血清ALT、AST、AKP、總膽紅素、直接膽紅素、膽汁酸等肝功能指標(biāo)；作肝臟病理和電鏡切片，觀察顯微和超微結(jié)構(gòu)變化，并作肝臟病理分級評分。 結(jié)果： 1．幼兔糞便益

4、生菌定量：使用雙歧桿菌和乳桿菌屬特異性引物作常規(guī)PCR，青春雙歧桿菌擴增產(chǎn)物大小為1428bp，植物乳桿菌擴增產(chǎn)物大小約為600bp，陰性對照大腸桿菌未見電泳條帶，說明此兩種屬特異性引物能準(zhǔn)確地鑒別雙歧桿菌和乳桿菌；通過對梯度稀釋的青春雙歧桿菌進行Real—time PCR靈敏度測定表明，10<'2>個細(xì)菌仍有陽性曲線生長；擴增產(chǎn)物溶解曲線顯示為單峰。PN組幼兔濕糞(0.05g)中雙歧桿菌和乳桿菌含量(對數(shù)值)分別為4.62±0.24和

5、4.29±0.49，顯著低于對照組(分別為5.84±0.92，5.14±1.07，P<0.01)和雙歧組(6.41±O.39，5.46±0.61，P<0.01)；雙歧組兩種細(xì)菌含量略高于對照組，但差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 2．腸屏障評價 ①腸道形態(tài)學(xué)：末端回腸病理切片顯示，PN組小腸絨毛明顯萎縮，排列紊亂；雙歧組小腸絨毛基本正常；顯微測量結(jié)果顯示，PN組小腸絨毛高度、隱窩深度、絨毛面積顯著低于對照組(P<

6、0.05)，而雙歧組和對照組比較，此3項指標(biāo)差異均無顯著意義(P>0.05)；超微照片顯示，對照組回腸微絨毛致密，排列整齊，上皮細(xì)胞間連接緊密；PN組幼兔微絨毛明顯稀疏，排列紊亂，上皮細(xì)胞間連接松散；雙歧組幼兔回腸微絨毛較對照組稍疏松，排列尚整齊，上皮細(xì)胞問連接致密。 ②腸道功能學(xué)：PN組幼兔腸系膜淋巴結(jié)、脾、肺、血細(xì)菌移 位率(77.5％)顯著高于對照組(2.8％，P<0.0125)。雙歧組細(xì)菌移位率(21.9％)和對

7、照組比較，差異有顯著意義(P=0.04)；和PN組比較，差異有非常顯著意義(P<0.01)；PN組血漿內(nèi)毒素為0.60±0.09Eu/ml，和對照組(0.09±0.03 Eu/m1)、雙歧組(0.11±0.03 Eu/m1)比較，差異有非常顯著意義(P<0.001)。HPLC結(jié)果顯示對照組幼兔尿中乳果糖、甘露醇排出率比值(L/M)為0.019±0.005，PN組幼兔L/M升高至0.038±0.008，和對照組比較，有顯著性差異(P<0.

8、01)。雙歧組LM為0.02±0.004，和對照組相當(dāng)(P>0.05)，較PN組LM顯著降低(P<0.01)。 3．肝功能評價 ①肝臟生化指標(biāo)：雙歧組幼兔血清膽汁酸和總膽紅素分別為(6.78±1.5)μm0l/L和(15.3±2.19)μm0l/L，和PN組(分別為17.3±1.3μm0l/L和26.6±3.6/μm0l/L)比較，差異有顯著性(P<0.05)；和對照組(分別為5.9±0.8μm0l/L和12.6±2.

9、7μm0l/L)比較，差異無顯著性(P>0.05)。 ②肝臟形態(tài)學(xué)：病理切片顯示PN組幼兔肝細(xì)胞大量脂肪變，可見點狀壞死、膽汁淤積和細(xì)胞凋亡。雙歧組肝細(xì)胞輕度變性、纖維增生。參照L0ff肝臟病理學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)，PN組分值明顯高于對照組和雙歧組(P<0.05)，而雙歧組和對照組比較，差異無顯著意義(P>0.05)。肝臟超微結(jié)構(gòu)顯示，PN組幼兔肝細(xì)胞內(nèi)含有較多的脂肪滴，線粒體腫脹，毛細(xì)膽管內(nèi)微絨毛稀疏、排列紊亂，部分細(xì)胞內(nèi)可見淤膽。雙歧

10、組幼兔肝細(xì)胞形態(tài)基本正常，無線粒體腫脹，肝細(xì)胞內(nèi)含有少量脂肪滴，毛細(xì)膽管內(nèi)微絨毛稍稀疏，排列尚整齊。 結(jié)論： 1．本研究應(yīng)用先進的分子生物學(xué)細(xì)菌定量方法，即Real-timePCR法，采用細(xì)菌屬特異性探針，對幼兔糞便中雙歧桿菌和乳桿菌定量。結(jié)果顯示，PN幼兔10天后糞便中雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量較對照組明顯減少；添加外源性雙歧桿菌后：PN幼兔糞便中雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量顯著增加。 2．應(yīng)用精確的HPLC結(jié)合脈沖安培檢測

11、器，測定幼兔尿中乳果糖和甘露醇含量，評價腸道通透性。發(fā)現(xiàn)幼兔腸外營養(yǎng)10天腸道通透性較對照組顯著增加；添加雙歧桿菌可以降低PN幼兔腸道通透性，增強腸屏障功能。 3．幼兔腸外營養(yǎng)10天可出現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪樣變，肝內(nèi)膽汁淤積，血清膽汁酸和總膽紅素升高等肝損害表現(xiàn)；添加雙歧桿菌可以減輕PN幼兔肝損害。 4．添加外源性雙歧桿菌可能通過調(diào)節(jié)幼兔腸道益生菌，即增加雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量，降低腸外營養(yǎng)幼兔腸道通透性，避免產(chǎn)生腸菌移位和內(nèi)毒素