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文檔簡介
1、人源胸腺素α原(prothymosin α,proTα)是具有促進細胞增殖和顯著的免疫刺激活性的酸性蛋白,主要用于治療腫瘤、肝炎、免疫系統(tǒng)等疾病。白介素2(interleukin 2,IL-2)是一種糖蛋白,它能增強NK細胞的活性,對腎細胞癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、直腸癌有明顯療效,但過量使用IL-2 會帶來不良反應。ProTα和IL-2 存在緊密的免疫刺激協(xié)同作用,proTα通過調(diào)節(jié)IL-2 誘導的NK 敏感細胞和LAK細胞毒性,使IL-
2、2的有效濃度降低一半。它們協(xié)同于自體瘤的效果明顯強于單獨使用IL-2的效果。ProTα和IL-2 聯(lián)合使用不但能提高抗腫瘤的效果,還可降低單獨使用IL-2 產(chǎn)生的毒副作用。 本研究利用PCR技術從前期構建好的pcDNA3.1-PTI 重組質(zhì)粒中克隆出proTα-linker-IL-2 融合基因,并對其進行改造,在5′端加入粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的信號肽序列。將改造好的proTα-linker-IL-2 融合
3、基因(PI)克隆至真核載體pVAX中構建成重組質(zhì)粒pVAX-PI,再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,通過菌落PCR和酶切篩選陽性單菌落,提取質(zhì)粒進行測序鑒定。測序結(jié)果顯示,改造后的融合基因序列與預期序列一致。 提取無內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒pVAX-PI 并定量分析。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞COS-7中進行表達,分別收集質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后24h、48h、72h、96h的細胞上清,用ELISA 法定量分析細胞上清中IL-2
4、蛋白表達量,結(jié)果顯示,24h、48h、72h、96h轉(zhuǎn)染上清中的IL-2蛋白含量分別為5.4、7.8、6.1、5.7ug/L。采用CTLL-2 依賴細胞株測得轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h、96h細胞上清中的IL-2 活性分別為43、58、54、49IU/ml 。將小鼠原代脾細胞與細胞轉(zhuǎn)染上清一起培養(yǎng)48h 后,MTT 實驗結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染上清能刺激小鼠脾細胞增殖,表達的融合蛋白具有proTα的活性。最后,通過ECL western blo
5、tting 分析和鑒定了表達的融合蛋白的分子量約為31kDa。本次研究初步發(fā)現(xiàn)pVAX-PI 對小鼠黑色素瘤有一定的抑制作用,并且對荷瘤鼠體內(nèi)細胞因子IFN-γ和IL-4 均有一定的誘生作用。pVAX-PI 質(zhì)粒免疫組的小鼠外周血清中IFN-γ和IL-4的含量隨時間的推移而逐漸上升。荷瘤小鼠接種pVAX-PI 質(zhì)粒后第5 周,ELISA定量分析小鼠外周血清中IFN-γ和IL-4的含量,肌肉注射聯(lián)合在體電脈沖刺激組分別為222pg/ml和
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