Minocycline對邊緣葉癲癇大鼠海馬損害的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、癲癇是一種常見的臨床綜合征，慢性、突發(fā)性和反復(fù)刻板發(fā)作為其主要臨床特點。盡管治療學(xué)不斷發(fā)展，仍有30％的患者不能被抗癲癇藥物所控制。其中很大一部分是顳葉癲癇。由于顳葉組織、海馬結(jié)構(gòu)與記憶形成、情感反應(yīng)的密切關(guān)系，使得這部分患者出現(xiàn)不同程度的認(rèn)識、情感以及其它高級神經(jīng)功能的損害，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。癲癇引起的海馬特定區(qū)域神經(jīng)元的脫失是神經(jīng)功能損害最主要的病理基礎(chǔ)。癲癇以后海馬組織的炎癥反應(yīng)，膠質(zhì)增生使局部組織癲癇閾值降低，進(jìn)一步加重病

2、情。Minocycline是四環(huán)素類廣譜抗生素，除了抗感染作用以外，還具有較強(qiáng)的抗炎癥和神經(jīng)元保護(hù)作用。在過去的數(shù)年內(nèi)，它被先后用于多種神經(jīng)系統(tǒng)變性病的治療，效果肯定。但是它對癲癇急性損害所致的神經(jīng)元損害和炎癥激活是否有效尚未研究。我們擬通過杏仁核注射KA的大鼠邊緣葉發(fā)作模型觀察Minocycline的保護(hù)作用，并對相應(yīng)機(jī)制進(jìn)行初步探討。 第一部分Minocycline對邊緣葉癲癇發(fā)作所致的海馬神經(jīng)元脫失的保護(hù)作用 采用

3、立體定向技術(shù)向大鼠右側(cè)杏仁核注射紅藻氨酸(KainicAcid，KA)建立邊緣葉癲癇發(fā)作模型，發(fā)作40min后腹腔注射30mg/kg安定終止發(fā)作。將成模動物隨機(jī)分為Minocycline治療組(MinocyclineTreatedGroup，MT組)和非治療組(KainicAcidGroup，KA組)，并以生理鹽水杏仁核注射作為假手術(shù)對照組(SalineControlGroup，SC組)。KA組和MT組大鼠處死時間點為癲癇終止后的2h、

4、4h、8h、24h、48h和7d，(各點動物數(shù)n=6)。SC組處死時間點為4、24、48h和7d(各點動物數(shù)n=6)。通過CresylViolet染色，觀察不同時間點海馬神經(jīng)元脫失情況。結(jié)果顯示，MT組和KA組海馬神經(jīng)元脫失情況在前三個時間點差異不大，從24h起差別逐漸明顯。7d時KA組右側(cè)海馬CA3區(qū)神經(jīng)元的脫失率為90.28％，MT組為48.55％，而且最后兩個時間點，KA組個別大鼠出現(xiàn)對側(cè)海馬CA3區(qū)和同側(cè)CA1區(qū)的神經(jīng)元脫失，而

5、MT組損害局限于CA3部分區(qū)域。結(jié)論：Minocycline可以減少癲癇后海馬神經(jīng)元的脫失。它對快速出現(xiàn)的神經(jīng)元丟失保護(hù)作用不大，而對緩慢啟動的神經(jīng)元丟失具有較強(qiáng)保護(hù)作用。 第二部分Minocycline對邊緣葉癲癇啟動的神經(jīng)元凋亡通路的影響 通過第一部分的研究，我們已經(jīng)證實了Minocycline對癲癇所致的海馬神經(jīng)元脫失具有保護(hù)作用，并推測這種作用與對抗神經(jīng)元凋亡的啟動有關(guān)。為驗證這一假設(shè)，本部分中我們首先用TUNE

6、L染色法檢測KA組和MT組凋亡細(xì)胞數(shù)量和分布的有無差異。然后通過免疫組織化學(xué)的方法對線粒體凋亡通路上兩個重要的抗凋亡因子——Bcl-2和Bcl-xl進(jìn)行定位檢測。最后通過免疫印跡法定量的分析抗凋亡因子水平變化和凋亡通路激活程度(17kDcaspase-3裂解片段水平)之間的關(guān)系，以探討Minocycline抗凋亡的可能機(jī)制。結(jié)果顯示，KA組和MT組均有TUNEL陽性細(xì)胞出現(xiàn)。MT組陽性細(xì)胞較局限的分布于CA3-A亞區(qū)，而KA組陽性細(xì)胞彌

7、散的分布于整個CA3區(qū)。24h、48h兩個時間點MT組陽性細(xì)胞數(shù)分別比KA組減少了54.79％和55.67％。免疫組化染色顯示Minocycline治療以后CA3區(qū)大錐體細(xì)胞胞漿內(nèi)Bcl-2含量增加，Bcl-xl變化不明顯。免疫印跡結(jié)果示：MT組caspase-3裂解片段水平比KA組明顯降低(P＜0.05)，接近SC組。Bcl-2在癲癇發(fā)作終止后2h表達(dá)水平開始上調(diào)，24h達(dá)高峰并持續(xù)超過72h。Bcl-xl水平變化不明顯，僅在MT組癲

8、癇發(fā)作終止后48h輕微上揚。上述結(jié)果表明：Minocycline的確通過抗凋亡作用減少癲癇發(fā)作所致的海馬神經(jīng)元損傷。它能減少caspase-3的裂解，抑制癲癇急性刺激所致的線粒體凋亡通路的激活。這一作用可能與抗凋亡因子Bcl-2水平上調(diào)有關(guān)。提示Bcl-2是癲癇發(fā)作后減少神經(jīng)元脫失的治療靶點。 第三部分Minocycline對癲癇發(fā)作后海馬炎癥反應(yīng)的影響 癲癇發(fā)作可以激活海馬炎癥反應(yīng)，使炎癥因子水平增高，膠質(zhì)細(xì)胞增生活化

9、。反過來，這些炎癥細(xì)胞和炎癥因子又可加重癲癇的病情。在這一部分，我們通過邊緣葉大鼠癲癇模型，研究Minocycline對癲癇引起的炎癥反應(yīng)是否有保護(hù)作用。我們使用免疫組化的方法檢測活化增生的星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，觀察其分布情況。用ELISA的方法檢測炎癥因子IL-1β和TNF-α的濃度變化。我們發(fā)現(xiàn)，癲癇發(fā)作能迅速激活星型膠質(zhì)細(xì)胞。發(fā)作終止后2h即可在雙側(cè)海馬看到肥大、深染、呈阿米巴樣的星型膠質(zhì)細(xì)胞，KA組和MT組之間沒有明顯差別。

10、小膠質(zhì)細(xì)胞的增生最早在癲癇終止后8h被觀察到。MT組增生情況較KA組輕。癲癇發(fā)作可以顯著升高IL-1β和TNF-α的濃度。24hKA組IL-1β濃度較對照組增高了3.43倍(P＜0.003)，而MT組僅增加60％。TNF-α濃度變化出現(xiàn)更早且更加明顯。KA組4h時TNF-α的濃度是對照組的15.2倍，24h時為57.93倍。差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.003)。Minocycline可以有效的抑制兩種炎癥因子的升高。通過上述資料我們