臍血單核細胞的優(yōu)化培養(yǎng)及移植治療成年鼠脊髓損傷的實驗研究.pdf

1、背景及目的：
　　 脊髓損傷（spinalcordinjury,SCI）是一種嚴重的中樞神經系統(centralnervesystem，CNS)損傷性疾病，目前尚缺乏有效的治療措施。
　　 近年來，隨著神經病理學和神經發(fā)育學研究的進展，干細胞移植逐漸成為一種治療SCI的新方法。臍血單核細胞(umbilicalcordblood-mononuclearcells,UCB-MNCs)是一種多潛能干細胞，集成了多種臍血干細胞成

2、份，其內的臍血間充質干細胞（umbilicalcordblood-mesenchymalstemcells，UCB-MSCs）是一種多潛能干細胞，具有多向分化性，尤其是神經分化特性。然而，臍血中的UCB-MSCs含量較少;傳統的分離、培養(yǎng)方法培養(yǎng)周期長，培養(yǎng)基中加入血清，有傳染人類的隱患。為避免上述不足，需要對UCB-MNCs進行優(yōu)化培養(yǎng)。
　　 為便于模擬損傷具體情況和病理生理狀態(tài)，科學地評價相關的治療策略，國內外相繼建立了一

3、些脊髓損傷模型，半橫斷塊狀缺損模型是目前常見的一種，然而，原模型制作方法在人為誤差，健側的損傷等問題。
　　 本研究通過:
　　 ①改進大鼠脊髓半橫斷塊狀缺損模型;
　　 ②優(yōu)化臍血單核細胞的培養(yǎng)方法;
　　 ③優(yōu)化培養(yǎng)的臍血單核細胞損傷脊髓移植。
　　 進而研究:
　　 ①改進后半橫斷塊狀缺損模型的特點及病理變化;
　　 ②優(yōu)化后臍血單核細胞的生物學特性及其神經分化;
　　

4、 ③優(yōu)化培養(yǎng)的臍血單核細胞對損傷脊髓的修復作用。
　　 方法：
　　 1、大鼠脊髓半橫斷塊狀缺損模型的改進:自制半橫斷刀。選成年SD大鼠，分組制造半橫斷塊狀缺損模型，A組用自制半橫斷刀改進方法制作模型，B組用11號刀片制作模型。術后觀察各組的并發(fā)癥和Basso，Beattie，BresnahanScale(BBBScale)運動功能評分，A組傷后6h、3d、7d、28d、56dHE及尼氏染色，觀察損傷邊緣組織結構及神經

5、元形態(tài)學變化。傷后6h、3d、7d、28d、56d檢測損傷段脊髓GFAP表達。
　　 2、臍血單核細胞的優(yōu)化培養(yǎng)及神經分化的實驗研究:首先采用正交實驗方法篩選影響UCB-MNCs培養(yǎng)的各因素，優(yōu)化培養(yǎng)條件。設立優(yōu)化組:培養(yǎng)瓶LN包被，UCB-MNCs以1.0×106L-1的密度接種于含10ng/mLG-CSF、50ng/mLSCF、20ug/LbFGF、20ml/LB27低糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。對照組:UCB-MNCs以1.0

6、×106L-1接種于含20ng/mlbFGF、體積分數為0.10FBS低糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。其后檢測各組培養(yǎng)成功率、細胞貼壁、增殖及形態(tài)學變化;流式細胞儀對各組行免疫表型分析;各組取1、2、3代細胞，免疫組織化學SP法檢測Nestin、NSE表達，RT-PCR檢測Nestin、NF、NSE、CDK5、SYNⅠ、p27kip-1基因轉錄水平變化。
　　 3、臍血單核細胞對大鼠脊髓半橫斷損傷修復的實驗研究:BrdU標記臍血單核細

7、胞。制作大鼠脊髓半橫斷損傷模型，成功后即進行分組并移植，試驗組將5ul優(yōu)化培養(yǎng)的UCB-MNCs(1×105cells/μl)懸液移植到缺損處明膠海綿中;對照組將5ul傳統培養(yǎng)方式培養(yǎng)的UCB-MNCs移植到缺損處明膠海綿中。術后觀察大鼠的一般情況，BBB評分進行運動功能檢測，9周時處死并取標本觀察大體標本、移植細胞存活及形態(tài)變化，檢測免疫組化NF的表達。
　　 結果：
　　 1、用自制半橫斷刀可以成功建立大鼠脊髓半橫斷

8、塊狀缺損模型，A、B組損傷側后肢的神經功能缺損無顯著性差異，但損傷對側后肢神經功能缺損有顯著差異，A組神經功能一過性缺失，14天后恢復正常，B組35天后功能穩(wěn)定且殘留神經功能缺損。大鼠脊髓半橫斷損傷后出現典型的形態(tài)學變化，
　　 2、篩選后優(yōu)化培養(yǎng)條件為:低糖DMEM培養(yǎng)基中含20ug/mlbFGF、50ng/mlSCF、10ng/mlG-CSF，并且培養(yǎng)瓶用LN包被的情況下，原代培養(yǎng)的細胞密度最高。優(yōu)化組細胞增殖優(yōu)于對照組(P

9、=0.00)、P3代UCB-MNCs中MSCs含量優(yōu)于對照組(P＜0.05)。免疫組化:優(yōu)化組1、2、3代細胞Nestin表達逐漸降低且差異有統計學意義（P＜0.05），對照組Nestin表達無明顯差異(P＞0.05);優(yōu)化組2、3代細胞的NSE表達明顯高于對照組（P＜0.01）。RT-PCR:優(yōu)化組P3代NFmRNA表達較P1代上調，差異有統計學意義（P＜0.05）。優(yōu)化組、對照組P3代CDK5mRNA表達均較P1代明顯上調（P＜0.

10、05）;優(yōu)化組P1代p27kip1mRNA表達較對照組降低且有明顯差異(P＜0.05)，優(yōu)化組p27kip1mRNA表達逐漸下調，對照組p27kip1mRNA表達無顯著變化（P＞0.05）;優(yōu)化組P3代SYNⅠmRNA表達較P1代明顯上調，差異有統計學意義（P＜0.05），而對照組P1、P3代SYNⅠmRNA表達差異無統計學意義（P＞0.05）。
　　 3、損傷后第1天，對照組患肢評分為0分，之后逐漸增加為9.64±0.73。實

11、驗組損傷后第1天患肢評分為0分，之后逐漸增加，相對于對照組，從第5周開始即有明顯的改善（P＜0.05）。術后9周，兩組塊狀缺損處均可見BrdU陽性表達細胞，差異無統計學意義(P＞0.05);兩組塊狀缺損區(qū)域均有NF的表達，試驗組NF的表達明顯均優(yōu)于對照組(P＜0.01)，實驗組NF陽性表達纖維呈束狀，而對照組NF陽性表達纖維呈點狀。
　　 結論：
　　 1、用自制的半橫斷刀可以成功建立制作簡單、重復性良好、神經組織缺損規(guī)

12、范一致的脊髓半橫斷塊狀缺損模型。
　　 2、采用正交試驗的方法可以篩選出臍血單核細胞的優(yōu)化培養(yǎng)條件，即培養(yǎng)瓶用LN包被，含20ug/mlbFGF、50ng/mlSCF、10ng/mlG-CSF的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。
　　 3、細胞因子加LN的方法誘導UCB-MNCs，可以使UCB-MNCs向較成熟神經細胞分化。
　　 4、優(yōu)化培養(yǎng)的UCB-MNCs體內移植有分化的方向性，較傳統培養(yǎng)的細胞利用效率高;可以整合到