慢性生長(zhǎng)激素對(duì)肝臟STAT5信號(hào)的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、背景：
　　 生長(zhǎng)激素(growth hormone，GH)是人體一種重要的激素，在出生后的生長(zhǎng)、代謝、老化及腫瘤的形成過(guò)程中發(fā)生重要作用。
　　 GH已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于臨床治療。最初，GH主要應(yīng)用于GH缺乏癥的治療，后來(lái)逐漸推廣到其它疾病的治療，例如，腸外瘺、肝硬化門(mén)脈高壓、急性壞死性胰腺炎、重癥感染、擴(kuò)張性心肌病、呼吸功能衰竭、慢性腎病等等。隨著應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，GH的療效及可能的副作用得到了越來(lái)越多的關(guān)注，包括生長(zhǎng)激素

2、激素抵抗、白血病、腫瘤等。為了更好地了解臨床副作用的機(jī)制，必然要深入到分子層面的研究。
　　 GH在體內(nèi)最重要的靶器官是肝臟。GH通過(guò)janus酪氨酸蛋白激酶2(anustyrosine protein kinase2，JAK)信號(hào)激活下游信號(hào)通路。轉(zhuǎn)錄因子STAT5(Signaltransducer and activators of transcription5)是GH在體內(nèi)調(diào)節(jié)代謝作用的主要效應(yīng)因子。正常情況下，GH與GH

3、R結(jié)合， JAK2可與GHR的胞內(nèi)段結(jié)合而發(fā)生自身磷酸化，然后磷酸化GHR，形成GH-GHR-JAK2的多聚體結(jié)合，為STAT5提供對(duì)接位點(diǎn)，STAT5磷酸化后，形成二聚體，轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核內(nèi)，與靶基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。而對(duì)GH-JAK2/STAT5信號(hào)通路負(fù)調(diào)解機(jī)制的研究目前多集中于GHR水平，及細(xì)胞因子抑制物(Suppressor of cytokinesignaling，SOCS)家族以及調(diào)節(jié)因子蛋白酪氨酸磷酸酶S

4、HP2(Src homology2domain containing phosphotyrosine phosphatase2,SHP2)。
　　 SHP2對(duì)生長(zhǎng)激素的調(diào)節(jié)研究報(bào)道很少，有個(gè)別報(bào)道認(rèn)為SHP2可和生長(zhǎng)激素受體結(jié)合。但SHP2可和生長(zhǎng)激素受體結(jié)合的生理病理意義還不清楚。為了更好地了解慢性GH治療對(duì)機(jī)體可能產(chǎn)生的副作用及機(jī)制，本研究采用HepG2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及正常的幼年BALB/c小鼠，是許多其它已經(jīng)發(fā)表的不同模型研究的

5、一個(gè)補(bǔ)充。
　　 目的：
　　 本課題通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究急慢性生長(zhǎng)激素刺激對(duì)STAT5信號(hào)的調(diào)節(jié)作用，探索GH抵抗的分子機(jī)制，及SHP2可能的作用。
　　 方法：
　　 一、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分
　　 1、常規(guī)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，細(xì)胞傳代均勻鋪4個(gè)孔，把4孔分為2組Control組和急性GH刺激組，每組2孔，待細(xì)胞長(zhǎng)至約90％后，予血清饑餓12小時(shí)，裂解細(xì)胞前20分鐘予

6、以急性GH刺激組GH刺激(GH濃度儲(chǔ)存濃度為1.33mg/ml，工作濃度為2000ng/ml，用無(wú)血清DMEM液稀釋)，予以對(duì)照組等體積的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液，裂解細(xì)胞提取總蛋白，Western blot蛋白分析法檢測(cè)p-STAT5、STAT5蛋白表達(dá)水平。
　　 2、常規(guī)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，細(xì)胞傳代均勻鋪4個(gè)孔，把4孔分為2組Control組和慢性GH刺激組，每組2孔，待細(xì)胞長(zhǎng)至約90％后，

7、予血清饑餓12小時(shí)，裂解細(xì)胞前6小時(shí)慢性GH刺激組予以GH刺激，予以對(duì)照組等體積無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液，至裂解前20分鐘實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均予以GH刺激，裂解細(xì)胞提取總蛋白，Western blot蛋白分析法檢測(cè)p-STAT5、STAT5蛋白表達(dá)水平。
　　 3、常規(guī)培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞傳代均勻鋪2個(gè)60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，隨機(jī)分為GH刺激組和Control組，待細(xì)胞長(zhǎng)至約90％后，予血清饑餓12小時(shí)，裂解細(xì)胞前6小時(shí)實(shí)驗(yàn)組予以GH刺激，

8、對(duì)照組予以等體積的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液，裂解細(xì)胞，提取總蛋白。免疫共沉淀分析法(CO-IP)檢測(cè)胞質(zhì)內(nèi)與CIS結(jié)合的GHR的表達(dá)水平。
　　 4、統(tǒng)計(jì)分析:所有結(jié)果經(jīng)Excel2010及SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以“算術(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(arithmetic mean±standard deviation，M±SD)”表示。兩組間比較若方差齊采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent-Samples T Test)，若方

9、差不齊則采用Satterthwaite近似t檢驗(yàn)，以P＜0.05視為有顯著性差異。
　　 二、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分
　　 1、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):6-8周正常幼年BALB/c小鼠32只，隨機(jī)編號(hào)為1-32，測(cè)量空腹體重。隨機(jī)分為兩組:對(duì)照組和慢性GH組，每組16只，對(duì)照組每天注射0.2ml PBS，慢性GH組每天按1μg/g體重劑量(溶于0.2ml PBS)腹腔注射rhGH，給藥3周。完成3周慢性生長(zhǎng)激素刺激后，臨處死前一天晚上23:00

10、饑餓小鼠，并保證飲水充足。處死前凌晨8點(diǎn)，把對(duì)照組和慢性GH組分別隨機(jī)分成非急性GH組(PBS+PBS組、慢性GH+PBS組)和急性GH組(PBS+急性GH組、慢性GH+急性GH組)。非急性GH組臨處死前20分鐘予腹腔注射PBS0.2ml，急性GH組予以腹腔注射生長(zhǎng)激素一次(1μg/g)。操作時(shí)對(duì)照組和慢性GH兩組交替進(jìn)行，先處理非急性生長(zhǎng)激素組后處理急性生長(zhǎng)激素組。處死前使用麻醉劑苯巴比妥充分麻醉后，快速摘取肝臟置入液氮中速凍，再移至

11、-80℃冰箱長(zhǎng)期保存?zhèn)溆谩?br>　　 2、比較慢性GH和對(duì)照組兩組各16只小鼠體重增長(zhǎng)情況。
　　 3、比較對(duì)照組和慢性GH組肝內(nèi)基礎(chǔ)STAT5及p-STAT5水平。低溫研磨非急性GH組（即PBS+PBS組、慢性GH+PBS組）肝臟綠豆大小組織，提取蛋白，western blot檢測(cè)STAT5及p-STAT5水平。
　　 4、檢測(cè)急性GH刺激對(duì)慢性GH組STAT5磷酸化水平的影響。低溫研磨慢性GH組（包括慢性GH+P

12、BS組，慢性GH+急性GH組）肝臟綠豆大小組織，提取蛋白，western blot檢測(cè)STAT5及p-STAT5水平。
　　 5、比較對(duì)照組及慢性GH組中急性GH刺激后的肝內(nèi)STAT5及p-STAT5水平。低溫研磨急性GH組（包括PBS+急性GH組，慢性GH+急性GH組）肝臟綠豆大小組織，提取蛋白，western blot檢測(cè)STAT5及p-STAT5水平。
　　 6、在無(wú)急性GH刺激時(shí)，比較對(duì)照組及慢性GH組GHR及S

13、HP2表達(dá)。低溫研磨非急性GH組（包括PBS+PBS組、慢性GH+PBS組）肝臟綠豆大小組織，提取蛋白，western blot檢測(cè)GHR及SHP2水平。
　　 7、比較對(duì)照組及慢性GH組在無(wú)急性GH刺激時(shí)GHR與SHP2相互結(jié)合的情況。低溫研磨非急性GH組（包括PBS+PBS組、慢性GH+PBS組）肝臟綠豆大小組織，按CO-IP步驟提取蛋白，以針對(duì)SHP2的蛋白沉淀肝臟SHP2蛋白，然后以western blot檢測(cè)沉淀蛋白中

14、的GHR水平。
　　 8、統(tǒng)計(jì)分析:所有結(jié)果經(jīng)Excel2010及SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以“算術(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(arithmetic mean±standard deviation，M±SD)”表示。兩組間比較若方差齊則采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent-Samples T Test)，方差不齊則采用Satterthwaite近似t檢驗(yàn)。P-STAT5、STAT5蛋白表達(dá)水平的比較采用t檢驗(yàn)，經(jīng)Bonfer

15、roni校正以P＜0.017視為有顯著性差異。GHR與SHP2的測(cè)定為兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P值＜0.05視為有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　 一、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1、Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示急性GH刺激組較Control組p-STAT5蛋白表達(dá)水平顯著提高(t=-22.649，P=0.000)，Western blot以GAPDH作內(nèi)參，兩組灰度比值比分別為0.513±0.052及

16、0.029±0.008，STAT5蛋白無(wú)顯著差異，兩組灰度值比值為1.225±0.088及1.146±0.102(t=-1.473，P=0.181)。
　　 2、在予以6個(gè)小時(shí)慢性刺激的慢性GH刺激組，以及予以等體積DMEM對(duì)照的Control組，臨裂解前20分鐘全部予以20分鐘急性GH刺激，慢性GH刺激組較Control組p-STAT5水平顯著降低(灰度比值比分別為0.237±0.043和0.959±0.298，t=5.868

17、，P=0.000)，而STAT5水平未見(jiàn)顯著差異，兩組灰度值比分別為0.875±0.086及0.788±0.079(t=-1.824，P=0.098)，Western blot以GAPDH作內(nèi)參。
　　 3、CO-IP結(jié)果顯示，慢性GH刺激組與Control組相比，與胞漿內(nèi)CIS結(jié)合的GHR蛋白表達(dá)水平顯著升高(t=14.016，P,=0.000)，兩組灰度值比值分別為1.896±0.193及0.222±0.075。
　　

18、 二、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1、慢性GH刺激導(dǎo)致小鼠體重增加，慢性GH組和對(duì)照組的小鼠相比，慢性GH組小鼠平均增加體重比PBS對(duì)照組小鼠重1.278g(t=-3.667，P=0.001)。兩組灰度值比值分別為3.883±0.962及2.605±1.008。
　　 2、慢性GH+PBS組小鼠肝臟細(xì)胞基礎(chǔ)的p-STAT5水平(0.367±0.124)顯著低于PBS+PBS組(1.058±0.091)(t=12.272，P=0

19、.000);但肝臟內(nèi)總STAT5蛋白水平無(wú)顯著差異，灰度值比值為0.741±0.157及0.799±0.086(t=0.927，P=0.370)，Western blot以β-Actin作為內(nèi)參。
　　 3、在慢性GH組中，與處死前予PBS處理的小鼠相比，急性GH可使小鼠肝臟細(xì)胞p-STAT5水平顯著升高(0.005±0.001 vs0.214±0.027，t=-21.544，P=0.000)，而STAT5水平無(wú)顯著差異(t=-

20、0.251，P=0.805)，兩組灰度值比值為0.625±0.046和0.632±0.060，Western blot以β-Actin作為內(nèi)參。
　　 4、急性生長(zhǎng)激素可使對(duì)照組及慢性GH組STAT5磷酸化，但慢性GH組的p-STAT5水平遠(yuǎn)低于PBS對(duì)照組(0.418±0.091 vs0.677±0.080，t=6.036，P=0.000)，STAT5水平無(wú)顯著差異(0.826±0.093 vs0.811±0.073，t=-0

21、.360，P=0.724)Western blot以β-Actin作為內(nèi)參。
　　 5、在無(wú)急性GH刺激時(shí)，對(duì)照組與慢性GH組相比，總GHR蛋白的表達(dá)無(wú)顯著差異，灰度值比值分別為1.280±0.297及1.178±0.368(t=0.611，P=0.551)。總SHP2亦無(wú)顯著差異，灰度值比值為1.297±0.287及1.400±0.272(t=-0.741，P=0.471)，Western blot以GAPDH作為內(nèi)參。

22、>　　 6、免疫共沉淀結(jié)果顯示，在無(wú)急性GH刺激時(shí)，慢性GH組內(nèi)與SHP2結(jié)合的GHR量較對(duì)照組高，兩組灰度比值比分別為0.537±0.090和0.282±0.113(t=-4.980, P=0.000)。
　　 結(jié)論：
　　 在HepG2細(xì)胞內(nèi)，慢性GH刺激導(dǎo)致STAT5對(duì)外源性GH的抵抗，其機(jī)制可能是GHR與胞漿內(nèi)CIS的結(jié)合增加。在小鼠體內(nèi)，慢性GH刺激導(dǎo)致肝臟p-STAT5的抑制，相應(yīng)的，GHR與SHP2的結(jié)合