養(yǎng)殖大菱鲆細(xì)菌性病原的鑒定及其免疫保護(hù)的初步研究.pdf

1、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)于1992年由黃海水產(chǎn)研究所引入國(guó)內(nèi)，之后在我國(guó)迅速形成工廠化大規(guī)模養(yǎng)殖。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大和集約化程度的不斷提高，各種疾病接踵而至，特別是細(xì)菌性疾病，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的損失。 通過對(duì)2004年的黃海所病研室收錄樣品流行病調(diào)查發(fā)現(xiàn)了兩種主要的細(xì)菌性疾病，依照外觀癥狀，將它們稱為出血癥和潰瘍癥。這兩種疾病死亡率高，常造成急性死亡。出血癥的主要癥狀為早期體色變暗，平衡失調(diào)，不再

2、攝食，少部分魚還出現(xiàn)了在水中狂游現(xiàn)象；隨著病情的發(fā)展，體表大面積出血，鰭條充血發(fā)紅，嚴(yán)重時(shí)可潰爛，解剖可見腸胃空，腸壁嚴(yán)重充血，肝臟腫大呈土黃色或出現(xiàn)血斑，脾臟、腎臟腫大并稍微褪色。潰瘍癥癥狀主要表現(xiàn)為體表病灶部位出血、肌肉潰爛、眼球凸出等，解剖可見鰓絲貧血，肝臟充血，腎臟和膽囊腫大，腸壁充血并呈透明狀，從出現(xiàn)發(fā)病癥狀起，大約一周后開始出現(xiàn)死亡。 從患出血癥的大菱鲆(Scophthalmusmaximus)體內(nèi)分離到一株病原菌M

3、N，革蘭氏陰性，彎或直短桿狀，具極生單鞭毛，可運(yùn)動(dòng)，TSB培養(yǎng)基上菌落半透明。生理生化特征測(cè)試結(jié)果表明，該菌與L.anguillarum極其相似，進(jìn)一步對(duì)其16SrDNA序列進(jìn)行分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果顯示MN菌與L.anguillarum自然聚類，親緣關(guān)系最近。綜合上述結(jié)果可將MN菌鑒定為L(zhǎng).anguillarum。用該菌感染牙鲆(Paralichthysolivaceus)，其半數(shù)致死量LD50=1.49×105CFU/尾魚。藥

4、敏試驗(yàn)表明菌必治、頭孢氨噻肟、羅美沙星等多種藥物對(duì)所分離的病原菌有較強(qiáng)的抑制作用。 從患潰瘍癥狀明顯的病魚中分離出優(yōu)勢(shì)菌并命名為H1，經(jīng)人工感染證實(shí)H1即為引起本次養(yǎng)殖大菱鲆體表潰瘍癥的病原菌。對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定揭示該菌革蘭氏染色陰性，菌體呈短桿狀，極生單鞭毛。綜合該菌在形態(tài)、生理生化、API20NE與API20E自動(dòng)鑒定結(jié)果、16SrDNA同源性等方面的特性，確認(rèn)H1為哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)，該菌對(duì)呋喃妥因、氯

5、霉素、菌必治等多種抗生素敏感。哈維氏弧菌是海水養(yǎng)殖魚類的常見致病菌，但作為養(yǎng)殖大菱鲆的病原菌屬首次報(bào)道。 受免動(dòng)物血清抗體效價(jià)是評(píng)價(jià)特異性免疫效果的一個(gè)主要指標(biāo)，抗體效價(jià)的高低通常顯示了免疫的成敗。用0.5％的福爾馬林滅活L.anguillarum制備滅活疫苗，采用腹腔注射法免疫牙鲆(P.olivaceus)，第一次免疫后50天進(jìn)行二次免疫。取免疫后不同時(shí)間的牙鲆血清2倍系列稀釋包被96孔酶標(biāo)板，利用非放射性標(biāo)記物地高辛(DIG

6、)標(biāo)記福爾馬林滅活的L.anguillarum疫苗在適當(dāng)緩沖液中與之結(jié)合，通過抗地高辛的酶標(biāo)抗體顯色系統(tǒng)，測(cè)定受免牙鲆特異性免疫應(yīng)答水平。結(jié)果顯示該間接ELISA法所測(cè)免疫組與對(duì)照組牙鲆抗體效價(jià)差異顯著，且所測(cè)結(jié)果與凝集法所測(cè)結(jié)果變化趨勢(shì)一致。從兩種方法對(duì)試驗(yàn)組的抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果可以看出，地高辛標(biāo)記抗原間接ELISA法的靈敏度比凝集法又較大的提高；與傳統(tǒng)的ELISA法測(cè)定魚類血清抗體效價(jià)相比，地高辛標(biāo)記抗原間接ELISA法不需要制備兔、

7、鼠或羊抗魚的二抗且靈敏度相當(dāng)或更高。以上結(jié)果表明地高辛標(biāo)記抗原間接ELISA法具有較高的靈敏度，且操作方便，可以作為測(cè)定血清抗體效價(jià)的一個(gè)首創(chuàng)的新方法。 在我國(guó)，利用疫苗來控制淡水魚類細(xì)菌性疾病，也已取得一定進(jìn)展；而海水魚類細(xì)菌性疾病疫苗的研究工作則剛剛起步，其研究和推廣應(yīng)用還需大量的工作。本研究針對(duì)海水魚類常見細(xì)菌性病原L.anguillarum為研究對(duì)象，制備其滅活疫苗，對(duì)牙鲆進(jìn)行了免疫效果的研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，該L.ang

8、uillarum滅活疫苗兩次腹腔注射接種牙鲆后，能夠提高受免魚非特異性免疫因子的活性，疫苗的接種對(duì)血清殺菌活力、溶菌活力和血細(xì)胞吞噬活力有較大影響，特別是對(duì)血清殺菌活力的影響最明顯，建議對(duì)疫苗的非特異性免疫影響研究中以血清殺菌活力、溶菌活力和血細(xì)胞吞噬活力為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)；試驗(yàn)還表明疫苗誘導(dǎo)的抗體效價(jià)明顯升高，免疫組血清抗體效價(jià)最高達(dá)1：4096～1：8192。用L.anguillarum對(duì)試驗(yàn)魚攻毒后，實(shí)驗(yàn)組免疫保護(hù)率達(dá)76.9％，且發(fā)