朱砂葉螨適應(yīng)取食棉花相關(guān)基因篩選及應(yīng)用.pdf

1、植食性昆蟲、葉螨與自然界植物在長期的進(jìn)化過程中，逐漸形成寄主單食性和寄主多食性兩種。朱砂葉螨（Tetranychus cinnabarinus）作為一種重要的多食性農(nóng)業(yè)害螨，能夠取食危害多種寄主植物。朱砂葉螨通過消化將從不同寄主植物獲取的食物代謝成營養(yǎng)物質(zhì)，為自身的生長發(fā)育提供物質(zhì)基礎(chǔ)，同時利用自身進(jìn)化的解毒代謝系統(tǒng)，將接觸到的外源有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)化代謝為無毒物，這被認(rèn)為是朱砂葉螨能夠適應(yīng)取食多種寄主植物的兩條關(guān)鍵代謝通路。
　　本文利

2、用高通量測序技術(shù)比較朱砂葉螨分別取食豇豆和棉花后數(shù)字基因表達(dá)譜，獲得大量朱砂葉螨適應(yīng)取食棉花的差異表達(dá)基因，明確了消化代謝和解毒代謝兩大通路中差異表達(dá)的相關(guān)基因;并從兩大通路中篩選出朱砂葉螨適應(yīng)取食棉花的重要相關(guān)基因，克隆獲得相關(guān)基因的開放閱讀框序列并驗(yàn)證其表達(dá)水平。在此基礎(chǔ)上，利用植物介導(dǎo)的RNAi技術(shù)將朱砂葉螨兩條P450基因的部分互補(bǔ)DNA序列導(dǎo)入到棉花植株使其表達(dá)獲得轉(zhuǎn)基因棉;通過qPCR技術(shù)檢測朱砂葉螨取食轉(zhuǎn)基因棉后體內(nèi)對應(yīng)靶

3、基因的表達(dá)水平;運(yùn)用種群生命表技術(shù)比較、分析朱砂葉螨取食轉(zhuǎn)基因棉后適合度代價變化，初步明確轉(zhuǎn)基因棉的抗螨效果。獲得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.采用高通量測序技術(shù)比較朱砂葉螨轉(zhuǎn)移取食棉花后(8h、50d)數(shù)字基因表達(dá)譜，結(jié)果顯示朱砂葉螨從豇豆轉(zhuǎn)移取食棉花后，有近500條基因差異表達(dá)，其中取食棉花8h后有174條基因差異表達(dá)（上調(diào)97，下調(diào)77），取食50d后有433條基因差異表達(dá)（上調(diào)384，下調(diào)49）。將差異基因比對到Nr、二斑

4、葉螨基因組、COG、KEGG和GO等數(shù)據(jù)庫，最終272條基因獲得功能注釋，其中與解毒代謝相關(guān)基因24條，與消化代謝相關(guān)基因17條。
　　2.根據(jù)表達(dá)譜獲得的差異表達(dá)基因，從中篩選出4條朱砂葉螨適應(yīng)取食棉花的重要相關(guān)基因。這4條基因表達(dá)差異倍數(shù)均高于4倍，表達(dá)豐度均超過18，功能分別注釋為:細(xì)胞色素P450單加氧酶（tcCYP1和tcCYP2），羧酸酯酶(tcCCE)和絲氨酸蛋白酶(tcSP)。分別克隆獲得tcCYP1基因開放閱讀框

5、1482 bp，GenBank登錄號為KR002098; tcCYP2基因開放閱讀框1512 bp，GenBank登錄號為KR002099; tcSP基因開放閱讀框891 bp，GenBank登錄號為KR002101;獲得tcCCE基因下游片段1417 bp，GenBank登錄號為KR002100。qPCR檢測結(jié)果顯示，4條基因表達(dá)趨勢與表達(dá)譜測序結(jié)果基本一致。
　　3.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將兩條P450基因的互補(bǔ)DNA序列導(dǎo)入棉花植

6、株培育轉(zhuǎn)基因棉，最終成功獲得四株（P2，P4，P5和P6）轉(zhuǎn)基因棉。qPCR技術(shù)檢測目的基因表達(dá)水平結(jié)果顯示，朱砂葉螨分別取食四株轉(zhuǎn)基因棉24h后，兩條P450基因在螨體內(nèi)的表達(dá)水平均無顯著差異;在P4植株生存一代后，螨體內(nèi)tcCYP1基因的表達(dá)水平顯著下調(diào);在P2植株生存一代后，螨體內(nèi)tcCYP2基因的表達(dá)水平顯著下調(diào)，取食其余植株后均未檢測到靶基因的下調(diào)變化。
　　4.運(yùn)用種群生命表技術(shù)比較朱砂葉螨取食轉(zhuǎn)基因棉和常規(guī)棉后各發(fā)育