番茄葉片白化轉(zhuǎn)綠控制基因wv的精細(xì)定位.pdf

1、番茄是一種世界性經(jīng)濟(jì)作物，其產(chǎn)品品質(zhì)及產(chǎn)量的形成受植物光合效率影響并與葉片中葉綠素的含量密切相關(guān)。葉色突變是一種常見且易于鑒定的表型，開展葉色突變體的研究對闡明高等植物葉綠素合成降解、葉綠體分化發(fā)育及光合作用調(diào)控機(jī)理，以及利用基因工程提高作物光合效率增加作物產(chǎn)量具有重要的理論價(jià)值。本研究以番茄葉片白化轉(zhuǎn)綠突變體white virescent(wv) LA1526為研究對象，通過對突變體的表型鑒定、遺傳分析、基因定位等研究，從植物生理、遺

2、傳和分子水平探究突變體表型形成的分子機(jī)理，為在番茄遺傳育種培育高光合效率的新品種提供一定的理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　1、wv突變體LA1526屬于環(huán)境敏感型突變體，其表型可能同時(shí)受溫度與光照影響。在冬季田間育苗過程中，突變體的葉片在三葉期前表現(xiàn)白化表型，隨后逐漸返綠，成熟葉片恢復(fù)正常，而頂端葉片一直保持黃化狀態(tài);在夏季田間以及恒溫綠化間育苗過程中，突變體頂端葉片不出現(xiàn)白化表型，始終保持黃化狀態(tài)。
　　2、wv突變體L

3、A1526光合生理指標(biāo)研究表明，突變體頂端葉片的葉綠素a含量與對照Ailsa Craig無顯著差異，但葉綠素b和總?cè)~綠素含量極顯著低于對照，總類胡蘿卜素含量極顯著高于對照;突變體頂端葉片光系統(tǒng)Ⅱ的實(shí)際光能轉(zhuǎn)換效率(Y(Ⅱ))和電子傳遞速率(ETR)均極顯著低于對照。利用透射電子顯微鏡(TEM)觀察葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)突變體頂端葉片中的葉綠體結(jié)構(gòu)基本完整，但與對照Ailsa Craig相比，其葉綠體內(nèi)囊體中的基粒片層排列雜亂，垛疊數(shù)較

4、少。另外，葉綠體中嗜鋨體數(shù)量明顯增多，且沒有觀察到淀粉粒等有機(jī)物合成。
　　3、通過比對Tanksley等1992年發(fā)布的番茄高密度分子連鎖圖譜和第2條染色體的ILs圖譜，推斷wv基因位于番茄第2條染色體長臂的中間區(qū)域，與Prx-2,3基因連鎖，位于番茄腺毛控制基因Wo上游，對應(yīng)于漸滲系IL2-3所滲入的片段。以wv突變體LA1526為父本，漸滲系IL2-3為母本進(jìn)行雜交，構(gòu)建F2遺傳分離群體。遺傳分析表明，LA1526的突變表型

5、受隱性核基因控制。
　　4、利用番茄基因組數(shù)據(jù)開發(fā)并篩選出12對具有穩(wěn)定多態(tài)性的InDel標(biāo)記用于目的基因定位。利用從IL2-3×LA1526的F2代作圖群體中分離出的186株具有突變表型的番茄單株及5對InDel標(biāo)記，通過圖位克隆技術(shù)，將wv基因定位于wv-c13和wv-c24標(biāo)記之間，與wv-c13、wv-c24分別相距0.27 cM和1.09 cM;進(jìn)一步擴(kuò)大F2代作圖群體，利用從中分離出的2368株具有突變表型的番茄單株，

6、最終將wv基因定位于wv-c53和wv-c75標(biāo)記之間，約94kb的物理區(qū)間內(nèi)，與wv-c53、wv-c75標(biāo)記分別發(fā)生1次和5次交換。
　　5、利用基因分析與預(yù)測網(wǎng)站，在候選區(qū)域及其下游邊緣預(yù)測到19個(gè)開放閱讀框（ORFs）。設(shè)計(jì)候選區(qū)域中所有基因以及Solyc02g079720、Solyc02g079730、Solyc02g079740、Solyc02g079750、Solyc02g079760、Solyc02g079770啟

7、動(dòng)子的擴(kuò)增引物，分別在LA1526和對照Ailsa Craig中擴(kuò)增測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在LA1526中，目標(biāo)片段均未在片段長度及堿基序列上發(fā)生變化。推測該結(jié)果產(chǎn)生的原因可能有兩種:一、突變發(fā)生在某個(gè)未擴(kuò)增測序的基因啟動(dòng)子中;二、突變表型由候選區(qū)域中某個(gè)基因表達(dá)量變化引起，而這種基因表達(dá)量的變化可能與表觀遺傳變異相關(guān)。
　　6、利用Q-RT-PCR方法，分析Solyc02g079720、 Solyc02g079730、Solyc02g

8、079740、Solyc02g079750、Solyc02g079760、Solyc02g0797706個(gè)可能與植物光合作用、葉綠體發(fā)育以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的候選基因在LA1526和對照Ailsa Craig葉片中的表達(dá)量。結(jié)果顯示，編碼硫氧還蛋白的Solyc02g079730在LA1526葉片中的表達(dá)量顯著低于對照Ailsa Craig;利用VIGS技術(shù)對候選基因進(jìn)行功能驗(yàn)證，分別構(gòu)建了Solyc02g079730、Solyc02g079