基于新型固態(tài)熒光碳量子點(diǎn)的微生物快速檢測(cè)技術(shù)研究及應(yīng)用.pdf

1、目的:
　　基于新型納米熒光材料——固態(tài)熒光碳量子點(diǎn)(solid-state fluorescent carbonnanodots，SCDs)，結(jié)合免疫層析技術(shù)和生物成像技術(shù)，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)條件下快速的微生物特異性檢測(cè)與總菌監(jiān)測(cè)，為微生物檢測(cè)/監(jiān)測(cè)提供可供選擇的新型技術(shù)手段。
　　方法:
　　1.SCDs的合成與光學(xué)性能分析:采用微波法一步合成SCDs，對(duì)SCDs的宏觀和微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，研究其光譜特征、熒光穩(wěn)定性、耐光漂白

2、性以及溶液pH、有機(jī)溶劑、離子等對(duì)SCDs熒光量子效率的影響，探討SCDs作為熒光探針在生物應(yīng)用中的可行性;
　　2.SCDs在干式快速檢測(cè)中的應(yīng)用研究:以SCDs作為熒光標(biāo)記物，以鼠疫菌的特異性抗體作為生物探針，基于雙抗體夾心的免疫層析原理，制備鼠疫菌SCDs免疫層析試紙，并對(duì)試紙的檢測(cè)性能進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià);
　　3.SCDs在液態(tài)快速監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用研究:以SCDs作為新型無(wú)毒的熒光染料，對(duì)以典型細(xì)菌為代表的總菌以及HeLa細(xì)胞

3、進(jìn)行快速染色，并對(duì)其染色機(jī)理進(jìn)行研究探討，與商用染料SYTO9進(jìn)行染色性能對(duì)比;初步將SCDs染色與流式細(xì)胞儀結(jié)合，對(duì)樣品進(jìn)行總菌計(jì)數(shù)。
　　結(jié)果:
　　1.合成了固態(tài)、液態(tài)均可以發(fā)光的SCDs，平均粒徑約2.3nm，分散性好，顆粒表面含有氨基、羥基、羰基等化學(xué)基團(tuán)，量子產(chǎn)率高，在固態(tài)和液態(tài)分別是37％和28％，λex=360±1nm，λem=458±1nm，發(fā)射光譜有激發(fā)光依賴性;熒光穩(wěn)定性強(qiáng)，避光保存30天強(qiáng)度基本不變，

4、耐光漂白;SCDs溶液濃度在6mg/ml時(shí)熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，pH值3-11，有機(jī)試劑10mg/ml PEG20000、10mg/ml SDS、10mg/ml BSA、1％ TritonⅩ-100、1％Tween20以及濃度為0.3mol/L-1 mol/L的Na+、K+、Cl-、PO43-對(duì)SCDs的熒光強(qiáng)度均沒有影響(P＞0.05), Zn2+、Cd2+、Mg2+、Ca2+、SO42-、Fe3+、Fe2+、Hg2+、NO3-對(duì)SCDs的熒

5、光強(qiáng)度有不同程度的抑制作用(P＜0.05)。
　　2.在干式快速檢測(cè)研究中，確定SCDs標(biāo)記抗體蛋白的條件:SCDs=0.5mg/ml，抗體濃度為50μg/ml;標(biāo)記緩沖液pH=7.2，0.03mol/L的PB;樣品處理液的成分包括50μl封閉液，3μl7.5％的干酪素，pH=7.2，37μl濃度為0.03mol/L的PB;制備了基于SCDs的鼠疫菌免疫層析試紙，可實(shí)現(xiàn)鼠疫菌的特異檢測(cè)，敏感性可達(dá)105CFU/ml。
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6、.在液態(tài)快速監(jiān)測(cè)研究中，SCDs可對(duì)以典型細(xì)菌為代表的總菌1min內(nèi)進(jìn)行無(wú)差別染色且不受其他生物雜質(zhì)的干擾;金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、炭疽桿菌芽孢對(duì)SCDs的1min滲透率分別是6％、6.7％、5％;核酸對(duì)SCDs的熒光強(qiáng)度沒有影響(P＞0.05)，SYTO9與核酸結(jié)合后熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(P＜0.05)。兩種染料的染色效果均較好，染色后活菌的熒光強(qiáng)度比死菌的強(qiáng)，染色后浸泡2h、避光保存30天熒光強(qiáng)度均不減弱。結(jié)合流式細(xì)胞儀，染色后的細(xì)菌因