棉花黃萎病菌致病相關(guān)基因VdPR1和VdPR3的克隆及功能分析.pdf

1、大麗輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)是引起棉花黃萎病的主要病原菌，該病害在全球范圍內(nèi)的產(chǎn)棉國家和地區(qū)大肆流行，造成嚴重的經(jīng)濟損失。但是由于其具有穩(wěn)定的休眠體微菌核、變異性強且與寄主協(xié)同進化，因此V.dahliae致病分子機制十分復(fù)雜。近年來，隨著V.dahliae基因組數(shù)據(jù)的公布，結(jié)合正向遺傳學(xué)和反向遺傳學(xué)手段對基因組中致病相關(guān)基因的功能進行不同層面的分析，推動了V.dahliae致病分子機制的研究進程，對

2、于靶向控制棉花黃萎病具有重要的意義。
　　前期研究，本課題組已經(jīng)建立了棉花黃萎病菌強致病力菌株Vd080的T-DNA插入突變體庫，通過2輪的致病力篩選，得到了25株單拷貝插入的低致病力突變體。本研究從其中2個低致病力突變體出發(fā)，克隆得到了致病相關(guān)基因VdPR1和VdPR3并對其進行功能分析。主要研究結(jié)果如下：
　　1.VdPR1和VdPR3的克隆和基因結(jié)構(gòu)分析。VdPR1位于V.dahliae第一條染色體上，由2239個堿基

3、組成，包括4個外顯子和3個內(nèi)含子，編碼464 aa。通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測得出VdPR1編碼的蛋白為潛在的分泌蛋白。VdPR3全長762 bp位于V.dahliae第一條染色體上，包括2個外顯子和1個內(nèi)含子，ORF的長度為321 bp，編碼106 aa，為假定蛋白。
　　2.基于同源重組原理，結(jié)合融合PCR、巢式PCR和Gateway技術(shù)，分別構(gòu)建了致病相關(guān)基因VdPR1和VdPR3的敲除載體;利用酶切連接的方法，分別構(gòu)建了VdP

4、R1和VdPR3的互補載體。通過ATMT技術(shù)進而獲得敲除突變體ΔVdPR1、ΔVdPR3和互補突變體ΔVdPR1-C、ΔVdPR3-C。
　　3.對致病相關(guān)基因VdPR1和VdPR3突變體的生長發(fā)育及致病性的研究發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株Vd080相比，敲除突變體ΔVdPR1和ΔVdPR3的菌落形態(tài)都發(fā)生了變化，菌落中微菌核數(shù)量明顯減少，在以纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基中，敲除突變體ΔVdPR1和ΔVdPR3的生長速率比野生型Vd080分別降

5、低了21％和53％，致病力測定結(jié)果表明，敲除突變體ΔVdPR1和ΔVdPR3都能引起發(fā)病延遲，且棉株的褐化率降低。野生型菌株Vd080接種24天后病情指數(shù)高達52.11±3.7，且造成多數(shù)棉株死亡，而敲除突變體ΔVdPR1病情指數(shù)為20.42±2.0～22.28±2.7，僅為野生型Vd080的41％，降低了59％，而敲除突變體ΔVdPR3的病情指數(shù)則是20.67±3.2～26.71±0.3，極顯著的低于野生型菌株。重新將致病相關(guān)基因Vd

6、PR1和VdPR3導(dǎo)入到缺失突變體中獲得的互補突變體ΔVdPR1-C、ΔVdPR3-C，不僅致病力得到了恢復(fù)，達到了野生型Vd080的水平，其利用纖維素酶的能力與野生型Vd080相比差異不顯著。通過qPCR測定了VdPR1、VdPR3突變體在棉花不同組織部位的生物量情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VdPR1和VdPR3也影響了V.dahliae在根部的定殖侵染和下胚軸中的擴展繁殖能力，呈現(xiàn)出與其致病力顯著相關(guān)的特性。表明對V.dahliae的致病力有重