應力與鐵皮石斛的生長及其相關基因表達和克隆研究.pdf

1、隨著Bio+X學科的興起,物理學與植物學的交叉與融合已受到國內外學術界的關注。國內外學者研究發(fā)現(xiàn):人為機械力加載對植物細胞的生長、分裂具有顯著的調控作用,且在適度的應力加載下植物細胞均優(yōu)先性垂直于應力矢量的伸長生長。然而,對于植物細胞的機械力信號感受、信號轉導機制的理解,以及應力對藥用植物的生長代謝及分子表達調控有何影響等方面,目前的研究工作都只是提供了零星的實驗結果,尚無系統(tǒng)、完整的途徑解釋。
　　本課題以珍貴的藥用植物鐵皮石斛

2、為研究對象,基于已有的工作基礎及研究方法,利用聲波應力加載、生化檢測、基因篩選克隆、和功能基因的生物信息學預測等多學科的研究手段和先進方法,研究聲波應力干預植物的生長代謝相關的抗氧化酶系統(tǒng)、代謝產物的含量變化、相關酶基因片段的擴增與表達、特異表達基因的篩選克隆及其生物信息學功能預測,實驗結果為揭示物理應力對植物生長代謝調控機制提供基礎依據(jù)和直接的分子生物學證據(jù),為藥用植物代謝產物的提高作新方法的嘗試,為尋找應力作用植物的功能基因和功能蛋

3、白作前期工作。
　　本實驗取得的研究結果如下:
　　1.聲波刺激對鐵皮石斛生長影響:研究發(fā)現(xiàn),適當?shù)穆暡☉?頻率1000Hz、聲強100dB)對鐵皮石斛組培苗的生長起明顯的促進作用,超出一定范圍時對其生長有抑制作用,這與本實驗室在菊花和擬南芥等模式植物中的研究結果相一致。但在測定聲波刺激對鐵皮石斛葉、莖、根等不同生長器官的抗氧化性酶活性的影響時又發(fā)現(xiàn),在應力作用下,鐵皮石斛抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化氫酶(CAT)

4、、超氧歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)等幾種主要抗氧化酶的活性普遍得到提高,如葉、莖和根中的APX活性平均提高了15.7％、29.5%和21.5%,CAT活性分別提高了12.3%、8.5%和26.6%;這也顯示,不同的抗氧化酶響應應力刺激的形式都有所差別。同一種酶,對聲波應力的響應在不同生長器官中的差別也較大,如莖的POD活性比根的對應力刺激要敏感,SOD活性根比莖葉反應要遲鈍。結果說明,聲波刺激植物組培苗可能造成植物細胞活性氧(

5、AOS)迸發(fā),以刺激植物細胞增殖,促進植物生長。推測AOS在應力信號傳遞的過程中,可能是一種重要的信號分子。
　　2.聲波刺激對鐵皮石斛代謝產物含量的影響:在聲波刺激下,鐵皮石斛多糖含量提高較為顯著,刺激組含量均高于對照組,平均提高了8.8%;總生物堿的含量提高了0.022%;可溶性蛋白質含量平均增加了14.4%,其變化呈現(xiàn)逐漸升高后逐漸降低的趨勢;脯氨酸的含量變化呈現(xiàn)波浪態(tài)勢,差異不很顯著;丙二醛含量刺激組較對照組降低了4.9%

6、。結果表明,聲波刺激對鐵皮石斛的代謝產物影響比較顯著,有利于鐵皮石斛多糖的積累,刺激了可溶性蛋白質含量的提高,聲波刺激很可能改善了代謝產物關鍵酶活性,促進或抑制相關代謝產物的含量,從而使植物適應應力刺激。
　　3.聲波應力對鐵皮石斛POD同工酶基因表達的影響:應力刺激沒有誘導出新的酶帶出現(xiàn),分子雜交結果與酶譜學一致。就整體而言,聲波應力在一定的時間內能夠增強植物POD基因表達,但對某一具體POD基因是起促進作用還是起抑制作用需要具

7、體分析。
　　4.特異表達基因的篩選、克隆和測序:應用mRNA差異顯示(DDRT-PCR)、PAGE電泳、銀染和反式Northern點雜交的技術對響應聲波應力的差異表達基因片段進行了篩選、克隆和測序。在聲波應力作用下,鐵皮石斛組培苗刺激組較對照組總RNA含量提高了3%;共篩選到4條差異性和重復性較好的基因片段,分別為:SA8、SA5、SG6和CC7。雜交結果顯示,SA8為聲波應力誘導優(yōu)勢表達條帶,SA5和SG6為聲波應力誘導性特異

8、表達條帶,CC7為聲波應力抑制性表達條帶。4個基因克隆片段長分別為:Clone-SA8,552bp;Clone-SA5,390bp;Clone-SG6,408bp;Clone-CC7,496bp。
　　5.克隆片段的核苷酸序列分析:①Clone-SA8基因片段中的18-527核苷酸編碼169個氨基酸,包含起始密碼子ATG和終止子密碼子TAA,可認為是一條較短的全多肽序列;通過Blastp程序在GenBank中搜索蛋白質相似性發(fā)現(xiàn),

9、Clone-SA8蛋白與多種動物的細胞分裂周期蛋白相關蛋白有較高的相似性;在與植物蛋白的序列比對中,發(fā)現(xiàn)與蓮屬植物(Lotuscorniculatusvar.japonicus)的細胞周期開關蛋白(cellcycleswitchproteinCCS52A,GenBank登錄號為AAY58271.1)在氨基酸水平上具有31%的一致性,50%的相似性;與擬南芥(Arabidopsisthaliana)的Srw1類似蛋白(Srw1-likep

10、rotein,GenBank登錄號為CAB44330.1和CAB78235.1)在氨基酸水平上具有31%的一致性,46%的相似性。②Clone-SA5基因序列與多種植物的α-微管蛋白(alpha-tubulin)基因家族中的有些基因的部分序列具有很高的相似性,其基因片段中的96-390核苷酸編碼98個氨基酸,包含起始密碼子ATG,但沒有發(fā)現(xiàn)終止子密碼子。③Clone-SG6基因序列與多種植物的質膜H+-ATPase酶基因家族中的有些基因

11、的部分序列具有很高的相似性,其基因片段中的4-408核苷酸編碼136個氨基酸,包含起始密碼子ATG,沒有發(fā)現(xiàn)終止子密碼子。④Clone-CC7基因序列未檢索到有同源性。
　　6.克隆片段的氨基酸序列分析及功能預測:①多序列比對分析顯示,鐵皮石斛Clone-SA5基因和Clone-SG6基因在進化上都非常保守,與很多物種有高度的相似性。②鐵皮石斛Clone-SA8序列與L.corniculatusvar.japonicusCCS52

12、A和擬南芥Srw1-like分別進行的雙重對比顯示,它們的相似度不是很強,局部形似性較高,但中間都有斷裂。Clone-SA8蛋白含有14個可能的結構區(qū)域或功能區(qū)域,分屬5個功能類型,分子量為18.932KD,理論等電點pI為9.67,化學方程式為C810H1313N253O265S3,半衰期為30hours,不穩(wěn)定指數(shù)68.49,脂肪族指數(shù)62.90,總平均疏水性-1.070,表明Clone-SA8蛋白為親水蛋白;其二級結構是混合型的,

13、主要由α-螺旋和環(huán)狀或轉角組成;沒有發(fā)現(xiàn)信號肽,說明該蛋白不是分泌型蛋白;沒有發(fā)現(xiàn)跨膜區(qū)域存在;沒有預測出合適的卷曲螺旋;有6個超過閾值的糖基化位點。最后,對應力與植物生長代謝和基因表達問題進行了初步的探討。聲波作為一種交變應力,對植物生長代謝和基因表達有顯著的影響。
　　本實驗所選擇的聲波模式是一種對鐵皮石斛生長代謝起促進作用的應力模式;通過剪切力、聲流現(xiàn)象、能量轉換等物理學效應增強細胞膜的通透性,加速物質的流動,改變相關酶的活