新恢復(fù)系雅恢2115稻瘟病抗性基因分析.pdf

1、水稻作為全球最重要的糧食作物之一，其高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)對于全球糧食安全起著至關(guān)重要的作用。由于受到非生物/生物的脅迫，每年水稻產(chǎn)量損失嚴重。稻瘟病是危害水稻產(chǎn)量的重要真菌病害，通過雜交選育抗稻瘟病品種是最經(jīng)濟、環(huán)保和持久有效的防治手段。但是稻瘟菌快速的遺傳進化導(dǎo)致選育初期還具有抗性的品種，在大面積種植幾年后抗性隨之喪失。因此，抗病選育需要持續(xù)投入以豐富種質(zhì)資源，從而戰(zhàn)勝稻瘟病，實現(xiàn)糧食穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)。
　　迄今為止，超過101個抗稻瘟病基因被鑒定

2、，23個抗稻瘟病基因被克隆。目前克隆的抗稻瘟病基因絕大多數(shù)都屬于NBS-LRR類型，其中有許多是等位基因或者是直系同源基因。
　　雅恢2115是四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理系選育的優(yōu)良恢復(fù)系。其配組的三系雜交稻宜香優(yōu)2115于2011年，2012年分別通過四川省和國家新品種審定。通過多年多點鑒定，雅恢2115及其與抗病、中抗、高感類型的不育系所配雜交稻組合均表現(xiàn)為抗稻瘟病，雅恢2115的稻瘟病抗性受顯性基因控制。本文研究目的是確定控

3、制雅恢2115抗稻瘟病的基因。通過田間抗性鑒定、室內(nèi)抗譜測定并結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，最終推導(dǎo)雅恢2115的主效抗稻瘟病基因為廣譜抗稻瘟病基因Pi2，實驗主要結(jié)果如下:
　　1，探明雅恢2115具有稻瘟病廣譜抗病性
　　通過田間抗性鑒定、室內(nèi)抗譜測定結(jié)果表明:雅恢2115對92個供試菌株的抗病頻率為100％，平均葉瘟率為0.22％，平均病情指數(shù)為0.05。分別含Pi2、Pi9、Pizt、Pi1、Pi5、Pikm單基因系的抗病頻率

4、分別為96.63％、90.57％、68.97％、28.74％、23.17％、93.87％;平均葉瘟率為0.58％、0.60％、56.48％、4.66％、65.41％、0.50％;平均病情指數(shù)分別為0.10、0.07、23.60、0.59、36.03、0.08。本研究表明，在四川還表現(xiàn)抗稻瘟病病基因有Pi2、Pi9、Pikm、Pi1，可加強其在四川抗病育種利用。其他已克隆的部分抗病基因在四川已經(jīng)或者正在喪失田間抗性。雅恢2115與抗病、中

5、抗、高感類型的不育系所配雜交稻組合，其葉瘟，穗頸瘟抗病級別介于0-3級，抗性頻率介于88.15％-100％，病情指數(shù)介于0.01-0.25，組合均表現(xiàn)較強的稻瘟病抗性。
　　2，熒光定量PCR表達量分析推測Pi2為雅恢2115主效稻瘟病抗性基因
　　通過設(shè)計已克隆的抗稻瘟病基因熒光定量PCR引物，利用熒光定量PCR技術(shù)檢測其在雅恢2115中的表達情況，結(jié)果表明:Pi2、Pib和Pia-RGA4在雅恢2115中表達量較高。而田

6、間抗稻瘟病基因單基因系已經(jīng)證實Pib、Pia-RGA4在四川喪失了田間抗性。因此，Pi2極有可能是雅恢2115抗稻瘟病的主效抗病基因。
　　3，稻瘟病抗病基因在雅恢2115中的等位克隆證實包含Pi2，Pi25無突變?nèi)L
　　通過已克隆的抗稻瘟病基因序列設(shè)計全長引物，以雅恢2115 DNA或cDNA為模板擴增后測序，在雅恢2115中得到Pi2、Pit、Pid2、Pi25、Pib、Pita、Pia基因全長。其中Pi2，Pi25無

7、任何突變。
　　4，Pi2連鎖標(biāo)記AP22對LTH/雅恢2115構(gòu)建的F2群體抗感單株具有有效的區(qū)分，證實雅恢2115中含有Pi2
　　以LTH為母本，雅恢2115為父本雜交后自交得到F1代，通過人工接種稻瘟病菌外加病圃內(nèi)自然誘發(fā)，調(diào)查F2代的抗、感單株，利用Pi2的特異性連鎖標(biāo)記AP22對感病群體和抗病群體進行連鎖分析。通過連鎖標(biāo)記分析，AP22能有效的對抗病和感病群體進行區(qū)分，進一步支持雅恢2115中含有抗病功能基因Pi

8、2的推測。
　　5，對雅恢2115中Pi2進行RNAi，轉(zhuǎn)基因陽性單株P(guān)i2表達量顯著降低，植株更加感病，證實雅恢2115是由Pi2提供主效稻瘟病抗性
　　為了進一步證明，本研究對雅恢2115中的Pi2進行RNA干涉。通過構(gòu)建Pi2基因RNA干涉表達載體pANDA-Pi2-RNAi，對陽性轉(zhuǎn)基因株系進行了Pi2表達量分析，與雅恢2115相比，其Pi2的表達量降低范圍介于55％-95％。表明干涉載體很好的抑制了Pi2的表達。通