胚胎第17天小鼠腎單位三維重建及其毗鄰關(guān)系分析.pdf

1、目的:
　　 腎臟在實現(xiàn)其生理功能的長期進(jìn)化中,經(jīng)過發(fā)生發(fā)育形成了空間排列精致的微細(xì)結(jié)構(gòu),包括皮髓質(zhì)中兩種腎單位的分布、腎小管不同節(jié)段的分布、腎小管和集合管以及腎小管和血管伴行關(guān)系等。文獻(xiàn)表明,腎臟在發(fā)生發(fā)育過程中的缺陷在成年將以某種疾病形式顯示出來,而對腎微細(xì)結(jié)構(gòu)演變規(guī)律的研究一直受技術(shù)手段的限制,鮮見詳細(xì)系統(tǒng)的研究報道。探索發(fā)生發(fā)育中小鼠腎單位形態(tài)演變的時空性、結(jié)構(gòu)之間的毗鄰關(guān)系,為闡明腎發(fā)生發(fā)育的分子生物學(xué)機(jī)制,以及腎生理

2、及病理學(xué)研究提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。
　　 腎臟發(fā)生發(fā)育重演了種系發(fā)生中的進(jìn)化現(xiàn)象,經(jīng)歷了無功能期的前腎、具有臨時泌尿功能的中腎,和功能性的后腎三個階段,后腎發(fā)育成永久腎。腎單位起源于后腎間充質(zhì),在輸尿管芽的誘導(dǎo)下,后腎間充質(zhì)細(xì)胞分化形成腎單位。腎單位的形態(tài)發(fā)生經(jīng)歷了間充質(zhì)細(xì)胞積聚、上皮樣結(jié)構(gòu)的囊泡期、逗號小體期、S小體期、腎小體和腎小管節(jié)段的分化發(fā)育,以及與集合管系的融合。
　　 本研究利用前期建立起來的三維重建技術(shù),以胚胎第

3、17天(E17d)小鼠腎組織連續(xù)切片形成的系列配準(zhǔn)顯微圖像為基礎(chǔ),追蹤腎單位腎小管的走行,建立其走行的坐標(biāo)數(shù)據(jù)庫,并使其走行可視化,進(jìn)而進(jìn)行結(jié)構(gòu)空間走行及毗鄰關(guān)系的分析。
　　 實驗方法:
　　 1、實驗動物
　　 選取25～30g成年健康昆明小鼠,雌、雄(2:1)同窩飼養(yǎng),每日早8時、中午12時、晚6時三次觀察受孕情況,以觀察到雌鼠陰道栓的最早時間計為胚齡0天(E0d)。
　　 2、樹脂包埋連續(xù)切片的制

4、備
　　 取孕齡17天孕鼠,2.5%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉后,剖腹取出胎鼠,打開胎鼠腹腔取雙側(cè)腎臟,4%多聚甲醛與1%戊二醛混合固定液浸泡固定24小時,經(jīng)腎門,與腎長軸垂直截切腎臟組織塊,入同種固定液續(xù)固定48h,PBS沖洗,鋨酸后固定,各級乙醇至丙酮脫水,丙酮與環(huán)氧樹脂EP812混合液浸透,單純樹脂EP812包埋。采用超薄切片機(jī)配鉆石刀連續(xù)半薄切片(2.5μm厚),所有切片進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色以顯示組織形態(tài)結(jié)構(gòu),用于

5、腎單位三維重建。
　　 3、顯微圖像獲取與配準(zhǔn)
　　 應(yīng)用“計算機(jī)-顯微鏡-數(shù)碼相機(jī)”圖像采集系統(tǒng)(OlympusAX70顯微鏡:OlympusDP50相機(jī),東京,日本),對E17d的連續(xù)切片進(jìn)行顯微鏡下拍照。圖像大小為2596×1889像素,每個像素相當(dāng)于1.83μm×1.83μm。圖像配準(zhǔn)過程在計算機(jī)Windows平臺上操作。其原理是,通過比較相鄰兩幅圖像內(nèi)生理對應(yīng)點的像素灰度值的相似性來確定每個圖像平移及旋轉(zhuǎn),使其

6、達(dá)到生理空間的一致[雪4,5]。首先得出相鄰兩幅圖的相對變換值(平移距離和旋轉(zhuǎn)角度),再通過求相對變換值的相加函數(shù)得出系列圖像中的每幅圖的絕對變換值,從而實現(xiàn)圖像配準(zhǔn)。
　　 4、數(shù)字追蹤與三維分析
　　 對E17d小鼠腎單位腎小管進(jìn)行數(shù)字追蹤,追蹤是通過C語言設(shè)計的程序在計算機(jī)Linux平臺上實現(xiàn)的。泌尿小管的追蹤始于腎門處的輸尿管芽,截止至與腎單位的連接處。血管的追蹤始于腎小體血管極的出球微動脈。追蹤過程自動生成一個

7、數(shù)據(jù)文件,記錄追蹤腎小管走行的空間坐標(biāo),基于此坐標(biāo)集,腎小管走行的毗鄰關(guān)系分析,以及腎小管長度測量等得以實現(xiàn)。小管長度的測量運用歐幾里德算法,即累加沿近端小管或出球微動脈走行的每兩個連續(xù)點的距離,得出沿近端小管或出球微動脈走行任意兩點之間的距離。X∑I-2√(xi-xi-1)2+(yi-yi-1)2+(zi-zi-1)2
　　 實驗結(jié)果:
　　 對E17d小鼠連續(xù)組織切片的形態(tài)學(xué)分析顯示,E17d小鼠腎臟可清楚的區(qū)分為周

8、圍的皮質(zhì)和中央的髓質(zhì)。腎臟被膜下的生腎區(qū)可見輸尿管芽未端分支大泡的各種斷面,其周圍是密集的基質(zhì)細(xì)胞,并可見由基質(zhì)細(xì)胞形成的囊泡體、逗號小體和S小體,其內(nèi)側(cè)可見Ⅲ期腎小體,而最內(nèi)側(cè)近髓質(zhì)的皮質(zhì)區(qū)分布為Ⅳ期腎小體及圍繞其周圍的自身近端小管和遠(yuǎn)端小管,此時,髓放線并不明顯,可見輸尿管芽穿過皮質(zhì)區(qū)到達(dá)腎被膜下,并形成對稱的分支泡。髓質(zhì)內(nèi)可見稀疏排列的、梯狀的間充質(zhì)及與其垂直排列的、成束的輸尿管芽,以及走行在其周圍的發(fā)育中的髓襻,腎乳頭已開始形成

9、。
　　 對E17d小鼠腎單位進(jìn)行數(shù)字追蹤表明,輸尿管芽在此期已有6級以上的二杈分支,分支的對稱性并不貫穿全程。最后以及分支末端形成大泡,每側(cè)連接2個以上的腎單位,它們中常常有一個逗號小體或S形小體。較成熟的腎單位髓襻深入髓質(zhì),并常常與輸尿管芽伴行,同時,近髓質(zhì)的腎單位的出球微動脈常攀附髓襻升支粗段走行,而髓襻降支周圍常常被發(fā)育中的血管叢包繞。
　　 結(jié)論:
　　 1、輸尿管芽在E17d已有6級以上的二杈分支,分