大鼠食管下端肌間神經(jīng)分布及苯扎氯銨毀損效果研究.pdf

1、目的：食管下端肌間神經(jīng)發(fā)育異?；驌p傷可導(dǎo)致食管下端運(yùn)動(dòng)性疾患，如胃食管返流、賁門(mén)失弛緩癥等，臨床上需要有合適的動(dòng)物模型來(lái)研究這些疾病。本研究通過(guò)正常SD大鼠食管下端肌間神經(jīng)發(fā)育解剖學(xué)觀察，及應(yīng)用不同濃度BAC毀損大鼠食管下端肌間神經(jīng)研究，試圖為今后提供不同的食管肌間神經(jīng)毀損模型，并為進(jìn)一步開(kāi)展與小兒LES肌間神經(jīng)異常性疾病有關(guān)的的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.取出生后14天(P14組)和成年大鼠(Adult組)SD大鼠

2、的LES及EB標(biāo)本，固定后石蠟包埋。 2.蛋白基因產(chǎn)物9.5(P6P9.5)免疫組化結(jié)合圖像分析評(píng)價(jià)LES肌間神經(jīng)發(fā)育情況。 3.nNOS和AchE免疫組化結(jié)合圖像分析評(píng)價(jià)LES氮能及膽堿能肌間神經(jīng)發(fā)育情況。 4.建立五種不同濃度BAC溶液食管下端肌間神經(jīng)毀損動(dòng)物模型：清潔級(jí)SD大鼠(200-250g)，按BAC濃度隨機(jī)分組為：0.025％組、0.05％組、0.1％組、0.2％組、0.4％組及生理鹽水組(對(duì)照組)

3、，每組40只。 5.食管下端肌間神經(jīng)鋪片研究，并進(jìn)行NADPH-d酶的組織化學(xué)染色，三維觀察肌間神經(jīng)的毀損與恢復(fù)情況。 6.PGP9.5、nNOS和AchE免疫組化定性和定量分析各組BAC處理段神經(jīng)元?dú)p情況。 結(jié)果： 1.成年鼠與P14幼年鼠(11.8±5.8個(gè)/橫切面)相比，LES的神經(jīng)元密度(6.6±4.1個(gè)/橫切面)逐漸下降(P＜0.01)，神經(jīng)元胞體增大(110.47±69.96μm2)、胞漿著

4、色加深。但食管體部神經(jīng)元的密度兩者之間無(wú)明顯分別。 2.成年鼠LES神經(jīng)元的胞體最長(zhǎng)徑(Dmax)(20.41±7.56gm)、胞核最長(zhǎng)徑(Nmax)(7.36±1.27μm)與陽(yáng)性神經(jīng)元胞體面(Area)(110.47±69.96μm2)較幼年鼠增大；成年鼠的積分光密度(IOD)(36.80±19.47)及平均光密度(OD)(0.348±0.060)較幼年鼠增加。 3.鋪片研究顯示BAC處理后第2周，部分細(xì)胞失去自然的

5、形態(tài)，邊緣變得參差不齊，胞漿染色變淡，其他濃度組亦出現(xiàn)相似情況；第4周神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，神經(jīng)纖維網(wǎng)絡(luò)稀疏，部分神經(jīng)纖維交叉處神經(jīng)元消失，僅剩神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。第8周神經(jīng)元大部分消失，神經(jīng)叢分布稀疏，神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)元減少，剩余神經(jīng)元胞漿染色均勻，外型自然，胞核清晰。 4.PGP9.5、nNOS、AchE免疫組化顯示，BAC處理后部分神經(jīng)元胞漿出現(xiàn)空泡化；部分神經(jīng)元胞核出現(xiàn)固縮，胞漿內(nèi)出現(xiàn)團(tuán)塊樣結(jié)構(gòu)，胞漿內(nèi)結(jié)構(gòu)變得疏松，胞核、胞漿分

6、辨不清；BAC處理4周后，食管下端縱、環(huán)肌之間神經(jīng)元消失，僅剩部分神經(jīng)元碎片。 5.所有濃度BAC處理8周，實(shí)驗(yàn)大鼠肌間神經(jīng)元個(gè)數(shù)與BAC濃度之間的關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，毀損后大鼠肌間神經(jīng)元密度與BAC濃度呈負(fù)相關(guān)，其直線回歸方程Y=4.55-11.87X，回歸系數(shù)為-11.87，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。即BAC濃度越高肌間神經(jīng)元?dú)p程度越重。 6.0.2％、0.4％組術(shù)后第2周密度1.50±1.06個(gè)/橫切面、1.2

7、5±0.71個(gè)/橫切面較同期對(duì)照組5.38±2.33個(gè)/橫切面開(kāi)始減少。第4、8周所有濃度組均開(kāi)始減少。 結(jié)論： 1.PGP9.5、riNOS、AchE特異性及敏感性高，能夠標(biāo)記大鼠不同生長(zhǎng)時(shí)期的食管肌間神經(jīng)元和BAC處理前后的神經(jīng)元。 2.生后SD大鼠食管下端肌間神經(jīng)元有一個(gè)自我成熟的過(guò)程，隨著日齡增長(zhǎng)SD大鼠食管下端肌間神經(jīng)元呈逐漸減少的趨勢(shì)，神經(jīng)元的胞體、胞核增大，胞漿染色加深； 3.BAC溶液能夠