復(fù)發(fā)性口腔潰瘍口腔微生態(tài)的研究.pdf

1、研究背景、目的和意義: 復(fù)發(fā)性口腔潰瘍（Recurrent Oral Ulcer，ROU），又稱“復(fù)發(fā)性口瘡”、“復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍”（Recurrent Aphthous Ulcer，RAU）或“復(fù)發(fā)性阿弗他口炎”（Recurrent Aphthous Stomatitis，RAS），是專指一類原因不明，具有周期性反復(fù)發(fā)作但又具自限性的局限性口腔粘膜潰瘍性損傷。該病是口腔粘膜病中最常見的潰瘍類疾病，患病率高達(dá)20%左右，居口腔粘

2、膜病首位。復(fù)發(fā)性口腔潰瘍發(fā)病時病變部疼痛劇烈，對患者工作與生活造成重要影響。臨床尚無明確有效的治療方法。因此，ROU的病因及發(fā)病機(jī)制研究對進(jìn)一步的臨床治療研究具有重要作用。本病病因至今不清，多方面的病因研究表明，ROU的發(fā)生發(fā)展可能與多種因素有關(guān)。國內(nèi)外文獻(xiàn)已報道的病因方面的研究包括免疫學(xué)異常，病毒、細(xì)菌感染，微量元素、精神神經(jīng)因素、遺傳因素影響及微循環(huán)障礙等，但尚無確切定論。 正常人體的口腔、腸道、呼吸道、泌尿生殖道等，均定植

3、一定數(shù)量的細(xì)菌，它們與宿主在長期進(jìn)化過程中形成了一個能獨立進(jìn)行物質(zhì)、能量交流的動態(tài)平衡的微生態(tài)系統(tǒng)。定居于口腔中的菌群稱為口腔正常菌群，它與宿主呈共棲的關(guān)系，他們彼此之間保持著動態(tài)平衡，對宿主起著有益和有害的雙重作用。口腔中的細(xì)菌，在正常情況下對宿主有多種有益的生理作用：如抵抗外來致病菌、產(chǎn)生多種營養(yǎng)物質(zhì)、促進(jìn)免疫應(yīng)答、產(chǎn)生過氧化物歧化酶（SOD）、清除自由基（O2-）及抗腫瘤等作用。一旦微生態(tài)平衡遭到破壞，發(fā)生菌群失調(diào)，上述生理作用發(fā)

4、生改變，對宿主可能造成損傷。 有學(xué)者提出ROU的發(fā)生發(fā)展可能與多因素相互作用有關(guān)。多方面的病因研究表明，ROU的發(fā)生發(fā)展可能與多種因素有關(guān)?？谇粌?nèi)環(huán)境與這些因素有著密切的關(guān)系。那么，ROU的發(fā)生發(fā)展是否與口腔的微生態(tài)相關(guān)呢？ROU患者口腔微生態(tài)是否發(fā)生了變化？又是哪些方面發(fā)生變化？本研究將從口腔菌群變化及口腔菌群構(gòu)成的角度，探討復(fù)發(fā)性口腔潰瘍是否與口腔微生態(tài)變化有關(guān)，為口腔潰瘍的防治探索新的依據(jù)。 材料和方法:

5、一、唾液菌群涂片觀察 收集臨床唾液標(biāo)本共62例。將其分為潰瘍組、愈合組及正常對照組三組。潰瘍組為臨床確診并處于潰瘍期的20例ROU患者，其中男性6例，女性14例，平均年齡24．7±3．13歲；愈合組為臨床確診并處于愈合期的21例ROU患者，其中男性9例，女性12例，平均年齡25．9±6．67歲；對照組為無ROU病史的21位健康成年人，其中男性9例，女性12例，平均年齡23．3±2．27歲。所有受試者均符合以下納入標(biāo)準(zhǔn)：所有受檢查

6、者取樣前1周內(nèi)未服用任何抗生素、鉍劑、抗酸劑及H2受體拮抗劑，1月內(nèi)未服用類固醇藥物或非類固醇類抗炎藥，如阿司匹林等；無其他系統(tǒng)疾??；無其他口腔黏膜??；無中、重度牙周病。 方法：唾液標(biāo)本直接涂片，革蘭氏染色，在顯微鏡10×100油鏡下，選取分布均勻的5個視野，分別計數(shù)各視野下細(xì)菌中革蘭氏陽性球菌（簡稱G+c）、革蘭氏陰性球菌（簡稱Gc）、革蘭氏陽性桿菌（簡稱G+b）、革蘭氏陰性桿菌（簡稱Gb）所占的構(gòu)成比，然后求其均值。分析了不

7、同菌群間的比值及構(gòu)成比的變化。 統(tǒng)計學(xué)分析：用SPSS13．0統(tǒng)計學(xué)軟件，對不同組別四類細(xì)菌的構(gòu)成比及不同菌群間的比值采用單因素方差分析（One-way ANOVA），采用Dunnett T3法進(jìn)行兩兩比較，以P<0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 二、復(fù)發(fā)性口腔潰瘍口腔唾液中鏈球菌、韋榮氏菌及奈瑟氏菌的定量分析 收集符合納入標(biāo)準(zhǔn)的臨床標(biāo)本，共95例。納入標(biāo)準(zhǔn)參考第一章。將其分為潰瘍組、愈合組及正常對照組三組。潰瘍組為

8、臨床確診并處于潰瘍期的39例ROU患者，其中男性13例，女性26例，平均年齡26．3±7．76歲；愈合組為臨床確診并處于愈合期的35例ROU患者，其中男性11例，女性24例，平均年齡25．3±5．47歲；對照組為無ROU病史的21位健康成年人，其中男性9例，女性12例，平均年齡23．3±2．27歲。 方法：用引物設(shè)計軟件Primerprimer5．0設(shè)計三種常見口腔細(xì)菌（鏈球菌、韋榮氏菌及奈瑟氏菌）16S rRNA基因擴(kuò)增引物，

9、并驗證其特異性；采用改良CTAB/NaCl法提取細(xì)菌標(biāo)本DNA；通過實時熒光定量PCR檢測鏈球菌、韋榮氏菌及奈瑟氏菌三種常見口腔細(xì)菌的含量。 統(tǒng)計學(xué)分析：用SPSS13．0統(tǒng)計學(xué)軟件，對不同組別三種細(xì)菌的含量采用單向方差分析（One-way ANOVA），采用Dunnett T3法進(jìn)行兩兩比較，以P<0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 三、基于細(xì)菌16S rRNA基因分析的復(fù)發(fā)性口腔潰瘍口腔細(xì)菌構(gòu)成差異分析 分別收集符

10、合納入標(biāo)準(zhǔn)的唾液標(biāo)本30例，納入標(biāo)準(zhǔn)參考第一章。將其分為潰瘍組、愈合組及正常對照組三組，每組10例。潰瘍組為臨床確診并處于潰瘍期的ROU患者；愈合組為臨床確診并處于愈合期的ROU患者；對照組為無ROU病史的健康成年人。 方法：采用改良CTAB/NaCl法提取細(xì)菌標(biāo)本DNA，并且制備成混合標(biāo)本。用細(xì)菌16S rRNA通用引物擴(kuò)增混合標(biāo)本，瓊脂糖凝膠電泳，用AlphaEaseFCStand Alone軟件行凝膠圖像分析。選擇回收純化

11、差異較明顯的條帶，測定片段序列并在GenBank中比對，分析差異條帶的種屬源性。 二、復(fù)發(fā)性口腔潰瘍口腔唾液中鏈球菌、韋榮氏菌及奈瑟氏菌的定量分析 潰瘍組鏈球菌及韋榮氏菌含量的對數(shù)值分別為7．30±0．89和8．29±0．77，均顯著低于對照組（8．15±0．55和8．93±0．76，P<0．01），鏈球菌及韋榮氏菌含量分別較對照組降低了66%和86%；潰瘍組與愈合組間鏈球菌及韋榮氏菌的含量的對數(shù)值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P

12、=0．64、P=0．17）；愈合組鏈球菌含量的對數(shù)值為7．51±0．81，顯著低于對照組（8．15±0．55，P<0．01），菌量較對照組降低67%，愈合組與對照組間韋榮氏菌含量的對數(shù)值差異統(tǒng)計結(jié)果P=0．056；奈瑟氏菌含量的對數(shù)值在三組間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0．921）。 三、基于細(xì)菌16S rRNA基因分析的復(fù)發(fā)性口腔潰瘍口腔細(xì)菌構(gòu)成差異分析 在200～800bp區(qū)間，于潰瘍組、愈合組及對照組均穩(wěn)定識別出3條

13、堿基數(shù)分別為230bp、400bp及770bp左右的三條條帶。潰瘍組、愈合組及對照組三條條帶灰度值的百分比有差異。在潰瘍組、愈合組及對照組條帶組成方面存在差異，各組在不同位置均有條帶缺失現(xiàn)象。條帶綜合波形圖也反映了潰瘍組、愈合組及對照組在條帶含量構(gòu)成方面存在差異。選擇回收純化片段暫命名為1號，片段大小約為180bp。測序結(jié)果通過生物信息學(xué)分析。1號blast比對結(jié)果示1號差異條帶70%與GenBank中Bacteroides vulqa

14、tus ATCC8482同源，匹配率74%。 結(jié)論: 1.潰瘍組、愈合組及對照組唾液菌群以球菌為主，潰瘍組革蘭氏陰性球菌構(gòu)成比減少，表明復(fù)發(fā)性口腔潰瘍唾液菌群構(gòu)成發(fā)生了變化。 2.復(fù)發(fā)性口腔潰瘍患者唾液中鏈球菌、韋榮氏菌含量發(fā)生了減少性變化，提示構(gòu)成口腔微生態(tài)的重要球菌菌群鏈球菌和韋榮氏菌含量的改變與復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。 3.細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增瓊脂糖電泳及圖像分析結(jié)果表明，復(fù)發(fā)性口腔潰