大黃素肝腸代謝特征及性別差異研究.pdf

1、大黃素(1,3,8-三羥基-6-甲基葸醌)是天然的葸醌類化合物中最重要的一種單體化合物。主要來自于大黃、蘆薈、番瀉葉等中藥材。大黃素藥理活性廣泛,尤其是近年來研究發(fā)現(xiàn)大黃素對多種腫瘤細胞具有細胞毒性[1,2],其機制可能是抑制腫瘤細胞的擴散[3]和粘黏[4],因此大黃素是一個具有開發(fā)價值前景的化合物,有著廣泛的市場。但是,盡管大黃素有良好的藥理活性和優(yōu)越的市場前景,目前大黃素藥理活性的研究仍以分子水平的較多,且基本集中于藥理作用方面,藥

2、物動力學及代謝資料對其體內(nèi)的相關研究尚未見深入報道,因此,研究大黃素的藥物代謝動力學對于大黃素的開發(fā)利用有重要意義。
　　 本文旨在對大黃素在不同種屬、不同性別的動物體內(nèi)、體外、在體的吸收代謝進行深入研究,以期從實驗動物數(shù)據(jù)分別推至男性用藥者和女性用藥者,對臨床合理用藥提供依據(jù)。
　　 1.大黃素的穩(wěn)定性和溶解度的考察
　　 為了開展大黃素在藥代動力學和大鼠在體腸灌流模型等實驗,必須清楚了解大黃素的穩(wěn)定性和溶解度

3、。本實驗用超高效液相色譜法對大黃素的穩(wěn)定性進行考察,并同時測定其溶解度。結果表明大黃素制成包合物溶解度明顯提高,能較好的溶解于HBSS溶液中,是能夠進行腸灌流實驗的,并且大黃素的HBSS溶液在pH值7.4下24h內(nèi)穩(wěn)定,結果表明,灌流實驗用的大黃素最好新鮮配制或者實驗前一天配制好。大黃素在pH為7.4到8.87之間比較穩(wěn)定。另外本實驗對采集、保存大黃素的最適條件進行了考察,發(fā)現(xiàn)酸化條件不利于大黃素的保存,適當?shù)膲A化和有機溶劑處理對大黃素

4、樣品的保存穩(wěn)定有利。
　　 2.大黃素及其代謝產(chǎn)物在大鼠體內(nèi)的藥物動力學研究
　　 采用LC/MS法測定血清中大黃素的濃度,其血藥濃度在0.001～20μg/ml范圍內(nèi)線性關系良好(R2=0.9979),并用同法測定了雌雄SD大鼠口服、靜脈給藥大黃素后的血藥濃度及藥物動力學參數(shù),結果表明,無論在雌性SD大鼠還是雄性SD大鼠,大黃素的口服生物利用度都相當?shù)?分別為7.5％(雄鼠)和5％(雌鼠)。
　　 靜脈給藥(4

5、mg/kg)后的大黃素在雌雄大鼠的體內(nèi)均表現(xiàn)為二室模型,分布較快,消除較慢,t1/2α為13.26±6.28min(雄鼠)和13.52±7.28min(雌鼠),t1/2β為187.378±174.52min(雄鼠),118.5033±83.09min(雌鼠),血藥濃度曲線下面積為AUC0-∞,i.v分別為430±160 mg·μg/ml(雄鼠),283±98 mg·μg/ml(雌鼠)?？诜o藥8mg/kg大黃素后僅檢測出少量原形藥物,大

6、黃素在體內(nèi)的血藥濃度變化無法用房室模型模擬,口服后大黃素的藥代動力學參數(shù)分別為Cmax:0.310.094μml(雄鼠)和0.039±0.011min(雌鼠)；Tmax:18±6.71 min(雄鼠),18.75±7.5min(雌鼠)；血藥濃度曲線下面積AUC0-∞,p.o分別為65.76±34.77 mg·μg/ml(雄鼠),33.82±4.09 mg·μg/ml(雌鼠),大黃素的藥代動力學參數(shù)存在一定的雌雄差異性。
　　 靜

7、脈給藥后的大黃素迅速代謝成大黃素葡萄糖醛酸化物,此代謝物在體內(nèi)的血藥濃度變化可用一室模型描述,t1/2Ke為167.4±50.9min(雄鼠)和251.3±114min(雌鼠),曲線下面積AUC0.∞,i.v分別為2210±980 mg·μg/ml(雄鼠),1540±290 mg·μg/ml(雌鼠)?？诜蟠簏S素葡萄糖代謝產(chǎn)物的藥代動力學參數(shù)分別為Cmax:6.69±1.058 μg/ml(雄鼠)和1.807±0.576 μg/ml(雌

8、鼠),血藥濃度曲線下面積AUC0-∞,p.o分別為2261.89±655.87 mg·μg/ml(雄鼠),458.50±373.29mg·μg/ml(雌鼠),大黃素葡萄糖醛酸結合物的藥代動力學參數(shù)存在顯著的性別差異性。
　　 藥代動力學研究表明大黃素在體內(nèi)的主要代謝途徑為UGT代謝,代謝速度快,而排泄速度較慢,這一結果是大黃素生物利用度低的因為之一。此研究內(nèi)容充實了大黃素藥物動力學方面的資料,為研究大黃素的吸收和代謝做了進一步的

9、輔證,也為臨床用藥方面提供了參考依據(jù)。
　　 3.大黃素的大鼠腸吸收動力學研究
　　 為了進一步證明大黃素生物利用度低的因為,采用在體大鼠腸灌流法研究大黃素的吸收代謝情況。腸灌流液經(jīng)UPLC法測定結果顯示,大黃素被部分代謝為葡萄糖醛酸結合物。在雄性大鼠中,大黃素的吸收量存在著腸段依賴性,其中十二指腸與空腸的吸收量最高,其次是回腸,結腸部位吸收最少(p<0.05)；相反的,在雌鼠中,無腸段問的顯著性差異(p>0.05)。在

10、四段腸中大黃素的吸收量存在顯著性性別差異(p<0.01)。
　　 另一方面,雄性大鼠四段腸上大黃素代謝產(chǎn)物的細胞排出量也存在著顯著性差異,代謝量最高的部位在十二指腸,其次在空腸,回腸和結腸部位吸收量最少(p<0.05)；而對于雌鼠,十二指腸與空腸中大黃素代謝產(chǎn)物的排出量最高,結腸中最少(p<0.05)。而四段腸代謝產(chǎn)物被排出細胞外的量也存在顯著性性別差異(p<0.01),這一系列的結果證明腸道中的代謝酶會影響大黃素的代謝,大黃素

11、在腸道細胞中有一定量的吸收,并存在明顯的雌雄差異性和腸段差異性。
　　 4.大黃素在不同雌雄動物的肝微粒體中的代謝研究
　　 為了考察大黃素在肝中的代謝情況,以求進一步解釋黃素生物利用度低的因為,本實驗采用LC/MS法檢測大黃素在五種動物(小鼠、大鼠、豚鼠、狗、人)的肝微粒體酶中經(jīng)UGT途徑代謝反應后的樣品。結果證明,無論在哪種肝微粒體酶作用下,大黃素都會迅速代謝并生成葡萄糖醛酸結合物。對代謝產(chǎn)物進行收集提純,經(jīng)1HNM

12、R法檢測后,確定此結合物為大黃素-3-O-葡萄糖醛酸。同一性別的五種動物的肝微粒體代謝大黃素的速率有顯著性種屬差異(p<0.05),而同種屬的動物的肝微粒體代謝大黃素的速率也存在著顯著性的性別差異(p<0.05)。結果還顯示大黃素的代謝在其高濃度的時候呈現(xiàn)飽和現(xiàn)象,大黃素在雄性豚鼠和男性的肝微粒體中的代謝符合典型的米氏方程(Michaelis-Mentenequation),而其在雄性小鼠和狗的肝微粒體中的代謝符合雙相抑制模式(Biap

13、hasic pattern),只有在雄性大鼠中大黃素的代謝呈自身激活模式(Autoactivation pattern)。在雌性動物組,小鼠大鼠、豚鼠和女性的肝微粒體中的代謝均符合典型的米氏方程(Michaelis-Menten equation),只有雌性狗的肝微粒體中的代謝符合自身激活模式(Autoactivation pattern)。
　　 Ⅰ相代謝反應中的大黃素代謝速度極慢,生成的代謝產(chǎn)物為羥基大黃素。將Ⅰ相反應和Ⅱ相

14、反應的同一時間的大黃素剩余量進行比較,大黃素的Ⅱ相代謝反應明顯快于Ⅰ相代謝反應,且Ⅰ相合并Ⅱ相代謝反應證明,Ⅱ相代謝占主導地位,并一定程度上抑制Ⅰ相代謝反應。
　　 本實驗結果說明大黃素在肝微粒體中極易發(fā)生葡萄糖醛酸結合反應,此代謝反應表現(xiàn)為顯著的種屬差異和性別差異。
　　 5.對雌雄SD大鼠不同腸段的腸微粒體中大黃素的代謝研究
　　 檢測方法同上,我們分別考察了大黃素在雄性SD大鼠和雌性SD大鼠的空腸、回腸微粒

15、體的代謝情況,不管是雄性SD大鼠還是雌性SD大鼠,大黃素在空腸微粒體中的葡萄糖醛酸化速率都大于在回腸微粒體中的速率

16、黃素在雌性SD大鼠的空腸微粒體的代謝也符合典型的米氏方程,而在回腸中的代謝表現(xiàn)出雙相抑制模式。
　　 結果顯示,大黃素的葡萄糖醛酸結合反應有顯著性的性別差異性和腸段差異性。
　　 6.對大黃素在12種人的UGT酶中的代謝研究
　　 為了初步判斷大黃素的主要代謝部位,本實驗采用超高效液相色譜法考察了大黃素在12種不同人的UGT酶中的代謝情況,除了UGT1A4和UGT2B4中大黃素無代謝外,其他10種UGT酶均對大黃

17、素的代謝有不同程度的影響,其中UGT1A家族占主要地位,大黃素在UGT2B家族的酶中代謝速率相對較慢。在UGT1A家族中,UGT1A10是大黃素的最主要代謝酶,其次是UGT1A8,UGT1A9,UGT1A1。大黃素在UGT1A9,UGT1A10,UGT2B15中的代謝均符合典型的米氏方程(Michaelis-Menten equation),而其在其他UGT酶中的代謝符合自身激活模式(Autoactivation pattern)。而大