調(diào)控LRP6在心力衰竭發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其機制.pdf

1、本研究首先通過升主動脈縮窄手術(shù)(TAC)構(gòu)建C57B/L6小鼠的壓力超負荷心肌肥厚模型，發(fā)現(xiàn)在壓力超負荷介導(dǎo)的心肌肥厚、心力衰竭的發(fā)生發(fā)展過程中存在LRP6以及p-LRP6水平的動態(tài)變化，其中p-LRP6在TAC術(shù)后3天，1周，2周明顯上調(diào)，但在TAC術(shù)后4周明顯下調(diào)。接下來對體外培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞分別給予機械牽張和血管緊張素Ⅱ刺激，發(fā)現(xiàn)隨著刺激持續(xù)時間的不同，LRP6以及p-LRP6的水平也呈現(xiàn)動態(tài)變化，且p-LRP6的水平亦呈現(xiàn)

2、先升高后降低的趨勢。此外，在TAC術(shù)后小鼠的心臟側(cè)群細胞(CSPs)中以及培養(yǎng)的新生大鼠CSPs機械牽張后也檢測到了p-LRP6水平的上調(diào)。
　　為了進一步說明LRP6參與了壓力超負荷介導(dǎo)的心肌肥厚、心力衰竭，我們包裝了shLRP6慢病毒和LRP6過表達慢病毒，分別感染新生大鼠心肌細胞并給予機械牽張刺激。發(fā)現(xiàn)LRP6干擾后，機械牽張所激活的心肌細胞MAPK信號、機械牽張所引起的ANP等肥厚基因表達上調(diào)以及心肌細胞表面積增大的效應(yīng)被

3、進一步增強;而LRP6過表達后則部分抑制了機械牽張激活的MAPK信號。此外，我們還發(fā)現(xiàn)shLRP6慢病毒干擾心肌細胞LRP6表達后，明顯上調(diào)了AT1受體的蛋白表達水平。免疫共沉淀結(jié)果提示在正常情況下心肌細胞上LRP6與AT1受體之間存在結(jié)合，而機械牽張會導(dǎo)致兩者結(jié)合減少。
　　為了在體內(nèi)進一步證實LRP6在壓力超負荷介導(dǎo)的心力衰竭發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，我們培育了Tamoxifen誘導(dǎo)的Cre介導(dǎo)的心肌特異性LRP6敲除的小鼠。結(jié)

4、果發(fā)現(xiàn)Tamoxifen誘導(dǎo)成年小鼠心肌特異性敲除LRP6后，小鼠迅速出現(xiàn)了嚴重的心力衰竭及死亡，心肌收縮力明顯減弱，組織學(xué)觀察心臟明顯擴大，心重體重比升高，電鏡檢測觀察到有線粒體自噬現(xiàn)象的發(fā)生，線粒體膜電位下降、線粒體功能受損。
　　綜合以上研究結(jié)果，我們認為LRP6在心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用，壓力超負荷介導(dǎo)的LRP6下調(diào)可能是從代償性心肌肥厚向心力衰竭轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵因素之一。
　　第一部分LRP6在壓力超負

5、荷介導(dǎo)的心力衰竭發(fā)生發(fā)展過程中的表達變化
　　目的:觀察LRP6的表達是否在壓力超負荷介導(dǎo)的心力衰竭發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)生變化。
　　方法:8-10周齡野生型C57B/L6小鼠行升主動脈縮窄手術(shù)(TAC)構(gòu)建心肌肥厚模型，分為假手術(shù)組、TAC3天組、TAC1周組、TAC2周組以及TAC4周組。取材前行心臟超聲以及血流動力學(xué)檢查評估造模成功情況。提取心臟組織蛋白，檢測LRP6、p-LRP6表達情況。體外培養(yǎng)新生大鼠心肌細胞，分別

6、給予機械牽張以及血管緊張素Ⅱ刺激不同時間，提取心肌細胞蛋白檢測LRP6、p-LRP6表達情況。流式細胞儀分選假手術(shù)組以及TAC術(shù)后小鼠心臟側(cè)群細胞(CSPs)，提取蛋白，行微量蛋白電泳(NIA)檢測p-LRP6水平。培養(yǎng)新生大鼠心臟側(cè)群細胞，機械牽張后行細胞免疫熒光染色以及提取蛋白行微量蛋白電泳檢測p-LRP6水平。
　　結(jié)果:小鼠壓力超負荷模型構(gòu)建成功。TAC術(shù)后心臟組織LRP6水平上調(diào)，p-LRP6在術(shù)后3天顯著上調(diào)，但當(dāng)心肌

7、肥厚進入失代償期即TAC術(shù)后4周時，p-LRP6水平下調(diào)。新生大鼠心肌細胞機械牽張6小時后LRP6水平升高，牽張10分鐘時p-LRP6水平即升高，牽張1小時左右達較高水平，后有所降低。使用Wnt3a分泌的抑制劑IWP2對機械牽張引起的p-LRP6升高無明顯影響。新生大鼠心肌細胞給予血管緊張素Ⅱ刺激6小時后LRP6水平升高，血管緊張素Ⅱ加入5分鐘時p-LRP6即明顯升高，6小時左右有所降低，使用IWP2對血管緊張素Ⅱ刺激引起的p-LRP6

8、升高影響亦不明顯。由于LRP6與干細胞的增殖、分化關(guān)系密切，我們觀察了心臟側(cè)群細胞的情況。發(fā)現(xiàn)壓力超負荷模型引起了心臟側(cè)群細胞的增殖，TAC術(shù)后小鼠心臟側(cè)群細胞中p-LRP6水平升高。培養(yǎng)的新生大鼠心臟側(cè)群細胞機械牽張后p-LRP6水平亦升高。
　　結(jié)論:在壓力超負荷模型中，LRP6、p-LRP6的表達發(fā)生明顯變化，提示LRP6可能是參與壓力超負荷介導(dǎo)的心肌肥厚、心力衰竭的因素之一。
　　第二部分LRP6參與壓力超負荷介導(dǎo)的

9、心肌肥厚機制的初步研究
　　目的:研究LRP6在壓力超負荷介導(dǎo)的心肌肥厚中發(fā)揮的作用。
　　方法:包裝shLRP6慢病毒，感染新生大鼠心肌細胞以干擾LRP6表達。LRP6干擾后給予機械牽張刺激8分鐘，提取細胞蛋白，檢測MAPK信號通路成員p-ERK、p-P38、p-JNK的表達水平。機械牽張不同時間點，提取細胞總RNA，行Real-Time PCR檢測胎兒型基因ANP、BNP、SAA的表達情況。機械牽張24小時用α-MH C

10、抗體行免疫熒光染色，測量心肌細胞表面積。包裝LRP6過表達慢病毒，使大鼠乳鼠心肌細胞過表達LRP6，機械牽張8分鐘、30分鐘檢測p-ERK、p-P38、p-JNK表達水平。檢測心肌細胞LRP6干擾后AT1蛋白表達水平以及mRNA表達水平。免疫共沉淀檢測新生大鼠心肌細胞中LRP6與AT1受體的相互作用。
　　結(jié)果:新生大鼠心肌細胞LRP6干擾后機械牽張8分鐘，p-ERK、p-P38、p-JNK較對照病毒牽張組顯著上調(diào)。心肌細胞LRP

11、6干擾后機械牽張，ANP、BNP、SAA的表達較對照病毒牽張組升高，心肌細胞表面積較對照病毒牽張組增加。心肌細胞過表達LRP6后機械牽張，在8分鐘時間點，p-ERK水平較對照病毒牽張組下調(diào):在30分鐘時間點，p-P38、p-JNK水平較對照病毒牽張組下調(diào)。大鼠乳鼠心肌細胞干擾LRP6后，AT1蛋白表達水平較對照組上調(diào)，而mRNA表達卻略有下降。免疫共沉淀結(jié)果顯示: LRP6與AT1受體存在結(jié)合，機械牽張后兩者結(jié)合減少。
　　結(jié)論:

12、新生大鼠心肌細胞LRP6干擾后進一步促進了機械牽張介導(dǎo)的心肌肥厚，這一作用可能與AT1受體的蛋白表達量增加有一定關(guān)系。LRP6對AT1受體蛋白表達量的調(diào)節(jié)可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平上。LRP6與AT1受體之間存在結(jié)合，機械牽張引起兩者結(jié)合減少。
　　第三部分Tamoxifen誘導(dǎo)的心肌特異性LRP6敲除小鼠出現(xiàn)心力衰竭表型及機制的初步研究
　　目的:在體研究LRP6在成體心臟中的作用。
　　方法:培育Tamoxifen誘導(dǎo)的

13、Cre介導(dǎo)的心肌特異性LRP6敲除小鼠。在小鼠8周齡時給予Tamoxifen腹腔注射連續(xù)3天(0.1mg/g/d)，使小鼠心肌特異性敲除LRP6。行心臟超聲、血流動力學(xué)檢查，包埋石蠟切片行HE染色，留取標(biāo)本行電鏡檢查，以觀察小鼠心肌特異性敲除LRP6后的心臟表型變化。提取心臟組織線粒體檢測線粒體功能，提取心臟組織總蛋白、線粒體蛋白、胞漿蛋白行Western Blot檢測以初步探索相關(guān)機制。
　　結(jié)果:心肌特異性敲除LRP6的小鼠迅

14、速出現(xiàn)了嚴重的心力衰竭表現(xiàn):左心室壁變薄、心腔擴大、EF值明顯下降，死亡率明顯升高。電鏡檢測觀察到有線粒體自噬現(xiàn)象的發(fā)生，部分區(qū)域結(jié)構(gòu)破壞嚴重，出現(xiàn)大量空泡并伴有大量脂滴聚集。線粒體膜電位下降，線粒體功能受損。與線粒體fission相關(guān)的p-DRP1(ser616)水平明顯升高，且DRP1向線粒體轉(zhuǎn)位，胞漿β-Catenin水平未見明顯下降。
　　結(jié)論:Tamoxifen誘導(dǎo)小鼠心肌特異性LRP6敲除后出現(xiàn)了嚴重心力衰竭的表現(xiàn)，這