內(nèi)皮型一氧化氮合成酶eNOS在糖尿病膀胱病變中的作用及干預(yù)研究.pdf

1、背景： 糖尿病膀胱病變是糖尿病最常見的合并癥之一，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，臨床缺乏有效的診斷方法和治療措施。內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)在正常生理狀態(tài)下產(chǎn)生的一氧化氮(NO)能夠擴(kuò)張血管，調(diào)節(jié)血壓，改變局部血流，抑制血小板聚集和抗平滑肌增殖。而在糖尿病腎病、視網(wǎng)膜病和糖尿病神經(jīng)病等糖尿病并發(fā)癥中，eNOS基因和蛋白表達(dá)出現(xiàn)異常調(diào)節(jié)，NO生物活性下降，導(dǎo)致微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能失調(diào)。eNOS基因和蛋白表達(dá)異常與糖尿病膀胱病變的發(fā)生

2、發(fā)展可能有關(guān)。 目的： 建立糖尿病膀胱病變的大鼠模型，對(duì)糖尿病膀胱病變進(jìn)行尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的評(píng)估，檢測(cè)膀胱組織中eNOS mRNA和蛋白兩個(gè)層面的表達(dá)水平，確定eNOS在膀胱中的活化狀態(tài)及其作用；明確膀胱微血管的超微組織學(xué)改變和氧化應(yīng)激水平，探討抗氧化治療能否逆轉(zhuǎn)糖尿病膀胱病變及其可能的作用機(jī)理。 方法： 1、通過(guò)向雄性SD大鼠腹腔內(nèi)注射STZ的方法構(gòu)建糖尿病大鼠模型；設(shè)置正常對(duì)照組、多尿?qū)φ战M和糖尿病組，

3、于誘導(dǎo)糖尿病后第6W和第12W進(jìn)行相關(guān)檢查。通過(guò)尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)對(duì)膀胱功能進(jìn)行評(píng)價(jià)；應(yīng)用RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)膀胱組織中eNOS mRNA和蛋白兩個(gè)層面的表達(dá)水平，確定其與膀胱功能的相關(guān)性；應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)膀胱中eNOS表達(dá)方式與強(qiáng)度。采用電鏡技術(shù)明確膀胱微血管超微組織學(xué)結(jié)構(gòu)的改變； 2、設(shè)置正常對(duì)照組、單純糖尿病組，糖尿病+L-NIO組和糖尿病+BH4組，通過(guò)應(yīng)用eNOS特異性抑制劑L-NIO和補(bǔ)

4、充eNOS關(guān)鍵輔酶BH4，采用Westernblot方法檢測(cè)藥物作用前后糖尿病大鼠膀胱組織中eNOS下游產(chǎn)物3-NT的含量，明確eNOS在膀胱中的活化狀態(tài)； 3、設(shè)置正常對(duì)照組、糖尿病+生理鹽水組和糖尿病+α-硫辛酸組，應(yīng)用RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)藥物作用前后膀胱組織中eNOS mRNA和蛋白表達(dá)水平，采用生化檢測(cè)技術(shù)明確氧化應(yīng)激狀態(tài)，探討抗氧化治療對(duì)糖尿病膀胱病變的作用及其機(jī)理。 結(jié)果：

5、1、與正常和多尿?qū)φ战M相比，糖尿病組大鼠血糖水平顯著升高，體重顯著下降(P<0.01)；與正常對(duì)照組相比，糖尿病組和多尿?qū)φ战M大鼠的每日尿量明顯增加(P<0.01)；尿流動(dòng)力學(xué)檢查結(jié)果顯示，6W時(shí)正常對(duì)照組、多尿?qū)φ战M和糖尿病組大鼠膀胱容量分別為0.75±0.04，1.62±0.15和2.29±0.16ml，而12W時(shí)則為0.86±0.06，1.93±0.10和2.65±0.26ml，各組間差異有顯著性；6W時(shí)各組大鼠殘余尿量分別為0.

6、064±0.003，0.112±0.013和0.232±0.010ml，而至12W時(shí)分別為0.071±0.004，0.129±0.024和0.561±0.061ml，各組間差異有顯著性；6W時(shí)各組大鼠單次排尿量分別為0.70±0.02，1.52±0.30和2.06±0.25ml，而12W時(shí)分別為0.80±0.04，1.77±0.11和2.09±0.21ml，各組間差異有顯著性；6W時(shí)各組大鼠排尿率分別為93.3±2.1％，93.2±2.

7、7％和90.0±2.5％，而至12W時(shí)分別為93.1±2.2％，93.8±3.2％和78.1±2.6％，各組間差異有顯著性；各組大鼠間最大膀胱內(nèi)壓力差異無(wú)顯著性(P<0.05)。糖尿病大鼠的膀胱壓力曲線出現(xiàn)多次小的壓力波動(dòng)，曲線不規(guī)則。RT-PCR結(jié)果顯示，6W時(shí)各組大鼠膀胱組織中eNOS mRNA表達(dá)強(qiáng)度分別為0.81±0.12，0.90±0.12，和1.98±0.16，而至12W時(shí)則分別為0.87±0.17.1.05±0.11和2.

8、89±0.23，各組間比較差異有顯著性(P<0.01)。Western blot結(jié)果顯示，6W時(shí)各組大鼠膀胱組織中eNOS蛋白表達(dá)強(qiáng)度分別為0.98±0.12，0.93±0.14，和2.28±0.16，而至12W時(shí)分別為1.03±0.13，1.14±0.11和3.12±0.20，各組間比較差異有顯著性(P<0.01)。免疫組化結(jié)果顯示eNOS在膀胱中主要表達(dá)于血管內(nèi)皮，其他組織未見明顯表達(dá)。與正常對(duì)照大鼠相比，6W和12W時(shí)糖尿病大鼠膀

9、胱eNOS表達(dá)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。糖尿病膀胱微血管的電鏡表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)內(nèi)線粒體嵴缺失，細(xì)胞核邊緣皺褶，異染色質(zhì)邊集，核膜間隙增寬、不均一。血管基底膜出現(xiàn)溶解，模糊，血管周圍膠原沉積。后期出現(xiàn)溶酶體，核糖體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少。 2、RT-PCR與Western blot結(jié)果顯示糖尿病組大鼠膀胱中的eNOS mRNA和蛋白表達(dá)強(qiáng)度高于正常大鼠，而L-NIO和BH4腹腔注射對(duì)eNOS mRNA和蛋白表達(dá)程度無(wú)明顯影響。Western

10、 blot結(jié)果顯示3-NT蛋白在糖尿病大鼠膀胱中的表達(dá)顯著高于正常組(0.39±0.05 vs 0.05±0.01，P＜0.01)，而L-NIO和BH4均顯著降低3-NT蛋白含量(0.25±0.05和0.21±0.02，P＜0.01)。 3、α-LA對(duì)糖尿病大鼠的血糖水平和體重均無(wú)影響。與DM+NS組相比，DM+α-LA組大鼠的膀胱容量顯著縮小(2.65±0.15 vs 1.93±0.09 ml，P＜0.05)，單次排尿量明顯減

11、少(2.09±0.10 vs 1.73±0.06，P＜0.05)，殘余尿量顯著減少(0.561±0.060VS 0.202±0.013ml，P＜0.01)，但是膀胱排尿率顯著提高(78.1±2.6％vs 89.6±2.6％．P＜0.05)。與正常對(duì)照組相比，DM+NS組膀胱中氧化應(yīng)激明顯增加，表現(xiàn)為MDA含量增加(0.64±0.05 vs 0.31±0.03 nmol/毫克蛋白，P＜0.01)，SOD活性下降(35.70±2.05 vs

12、 15.23±1.17微克蛋白，P＜0.01)，CAT活性降低(83.45±8.48 vs29.86±4.97微克蛋白，P＜0.01)；而α-LA治療則使MDA含量下降(0.47±0.05 nmol/毫克蛋白)，SOD和CAT活性增加(27.91±2.09和48.50±3.75微克蛋白)，(P＜0.01)。同時(shí)，α-LA治療顯著降低膀胱中eNOS mRNA和蛋白的表達(dá)水平(3.01±0.27 vs1.85±0.28和3.89±0.33

13、vs 2.75±0.24，P＜0.05)，降低3-NT蛋白表達(dá)(0.61±0.07 vs0.31±0.05，P＜0.01)。 結(jié)論： 1、STZ-糖尿病大鼠的膀胱功能失調(diào)表現(xiàn)與人類相似，可以作為糖尿病膀胱病研究的可靠的動(dòng)物模型。 2、糖尿病大鼠膀胱組織中eNOS在mRNA和蛋白兩個(gè)層面上的表達(dá)水平均明顯上調(diào)，且呈時(shí)間依賴性進(jìn)展。 3、糖尿病大鼠的膀胱功能失調(diào)隨著病程的進(jìn)展而進(jìn)行性加重，與eNOS表達(dá)強(qiáng)度呈

14、負(fù)相關(guān)，可以作為膀胱功能的評(píng)價(jià)指標(biāo)。 4、糖尿病大鼠膀胱的微血管損傷隨著病程的進(jìn)展而進(jìn)行性加重，與膀胱功能失調(diào)程度相一致，與eNOS表達(dá)強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)?？梢宰鳛樘悄虿“螂撞〉男螒B(tài)學(xué)評(píng)價(jià)和診斷指標(biāo)。 5、糖尿病大鼠膀胱組織中eNOS處于脫耦聯(lián)狀態(tài)，是膀胱組織中一個(gè)重要的超氧化物來(lái)源。 6、糖尿病膀胱組織中氧化和抗氧化系統(tǒng)失平衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激。 7、抗氧化治療通過(guò)恢復(fù)氧化與抗氧化系統(tǒng)之間的平衡，下調(diào)eNOS基因