N-,a-HS藥物后處理對(duì)心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷的影響及機(jī)制的探討.pdf

1、目的：通過(guò)培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心室肌細(xì)胞，建立缺氧/復(fù)氧模型，以模擬在體心肌缺血/再灌注損傷，觀察NaHS后處理對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。 方法： 采用Ⅱ型膠原酶消化法，結(jié)合差速貼壁法和化學(xué)試劑抑制法分離純化1～3天SD大鼠心室肌細(xì)胞，分離的心肌細(xì)胞培養(yǎng)于含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和自發(fā)搏動(dòng)情況，并通過(guò)a-肌動(dòng)蛋白和心肌特異性肌鈣蛋白cTnT免疫熒光法對(duì)培

2、養(yǎng)心肌細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 選用培養(yǎng)72小時(shí)的單層心肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分7組：①空白對(duì)照組：心肌細(xì)胞正常培養(yǎng)；②缺氧/復(fù)氧組(H/R組)：③NaHS藥物預(yù)處理組：使用含NaHS(終濃度1μmol/l)的復(fù)養(yǎng)液孵育細(xì)胞5min，后換用缺氧液孵育5min，重復(fù)3次，再對(duì)細(xì)胞進(jìn)行缺氧干預(yù)3h，復(fù)氧干預(yù)1h；④NaHS藥物后處理組：缺氧干預(yù)3h后，使用含NaHS(終濃度1μmol/l)的復(fù)氧液孵育細(xì)胞5min，后換用缺氧液孵育5min，重復(fù)

3、3次；再進(jìn)行復(fù)氧干預(yù)1h；⑤NaHS藥物后處理+格列苯脲組：在后處理中三個(gè)復(fù)氧缺氧循環(huán)的復(fù)氧液中同時(shí)加入終濃度為10μmol/l的格列苯脲；⑥NaHS藥物后處理+5-HD組：在后處理中三個(gè)復(fù)氧缺氧循環(huán)的復(fù)氧液中同時(shí)加入終濃度為100μmol/l的5-HD：⑦NaHS藥物后處理+蒼術(shù)苷組：在后處理中三個(gè)復(fù)氧缺氧循環(huán)的復(fù)氧液中同時(shí)加入終濃度為10μmol/l的蒼術(shù)苷。 實(shí)驗(yàn)終止后，在倒置相差顯微鏡下觀察各組心肌細(xì)胞形態(tài)及自發(fā)搏動(dòng)情況

4、，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，激光共聚焦顯微技術(shù)觀測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，采用硫代巴比妥比色法與黃嘌呤氧化酶法，分別對(duì)各組MDA含量、LDH活性及SOD活性進(jìn)行測(cè)定。 結(jié)果： 1．細(xì)胞鑒定：倒置顯微鏡下可見細(xì)胞成簇生長(zhǎng)，有規(guī)律的自發(fā)性搏動(dòng)，頻率約90～120次/分。熒光倒置顯微鏡下可見胞漿內(nèi)呈現(xiàn)綠色熒光，即胞漿內(nèi)表達(dá)a-肌動(dòng)蛋白與肌鈣蛋白cTnT，符合心肌細(xì)胞的特征。 2．各組心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較：空白組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，

5、成簇生長(zhǎng)，搏動(dòng)明顯；H/R組心肌細(xì)胞偽足縮短或消失，折光性下降，搏動(dòng)減弱甚至消失；NaHS藥物后處理組與NaHS藥物預(yù)處理組細(xì)胞生長(zhǎng)較好，形態(tài)變化小于H/R組；NaHS藥物后處理+格列苯脲組、NaHS藥物后處理+5-HD組、及NaHS藥物后處理+蒼術(shù)苷組細(xì)胞形態(tài)與H/R組相似，生長(zhǎng)較差。 3．各組細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度的比較：H/R組鈣離子熒光強(qiáng)度明顯高于空白組(595.99±33.62vs197.17±17.97，p＜0.05)

6、，NaHS藥物預(yù)處理及后處理組熒光強(qiáng)度均低于H/R組(304.50±20.81vs595.99±33.62，276.66±25.15vs595.99±33.62，均p＜0.05)，兩者減輕鈣超載的程度無(wú)明顯差異(p＞0.05)。NaHS藥物后處理+格列苯脲組及NaHS藥物后處理+5-HD組熒光強(qiáng)度均高于NaHS藥物后處理組(506.39±23.56vs276.66±25.15，450.23±30.48vs276.66±25.15，均p＜

7、0.05)，兩者之間無(wú)明顯差異(p＞0.05)。NaHS藥物后處理+蒼術(shù)苷組熒光強(qiáng)度亦明顯高于NaHS藥物后處理組(450.23±30.48vs276.66±25.15，p＜0.05)。 4．各組心肌細(xì)胞凋亡百分率的比較：空白組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，H/R組出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞，并有部分壞死細(xì)胞，與空白組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(51.40±4.18vs6.60±0.89，P＜0.05)。NaHS藥物預(yù)處理及后處理組B4區(qū)和B2區(qū)的細(xì)胞分布均明

8、顯減少，凋亡率均較H/R組明顯減低(24.60±2.47vs51.40±4.18，18.80±1.56vs51.40±4.18，P＜0.05)，二者的保護(hù)作用無(wú)明顯差異(p＞0.05)。NaHS藥物后處理+格列苯脲組、NaHS藥物后處理+5-HD組、及NaHS藥物后處理+蒼術(shù)苷組凋亡率均高于NaHS后處理組(43.30±3.58vs18.80±1.56，43.80±2.09vs18.80±1.56，45.70±0.72vs18.80±1

9、.56，均P＜0.05)。 5．各組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性及心肌細(xì)胞MDA含量和SOD活性的比較：H/R組LDH活性及MDA較空白組明顯升高(p＜0.05)，而SOD活性較空白組顯著下降(p＜0.05)；NaHS藥物預(yù)處理及后處理組LDH活性、MDA及SOD活性均與H/R組有顯著差異(p＜0.05)。NaHS藥物后處理+格列苯脲組、NaHS藥物后處理+5-HD組、及NaHS藥物后處理+蒼術(shù)苷組與NaHS藥物后處理組有顯著差異(p