OSAHS的炎性損傷及與高血壓和動脈粥樣硬化關(guān)系的基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的：在第一部分中建立阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)模式間歇低氧(IH)/再氧合(ROX)氣體環(huán)境模型，而后，應(yīng)用這一模型探討①OSAHS模式IH以及持續(xù)低氧(CH)暴露時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中炎性分泌蛋白的變化[白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNFα)](研究1)，②內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞表面炎性蛋白的變化[核因子κB(NF-κB)和細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)](研究2)以及③內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的核內(nèi)轉(zhuǎn)位情況

2、[核因子κB(N-κB)](研究3)。在第二部分中闡述不同間歇低氧(IH)程度、IH時(shí)間和再氧合(ROX)時(shí)間以及持續(xù)低氧(CH)模式家兔在體頸動脈體(CB)和頸總動脈在體模型建立過程。而后，應(yīng)用該模型探討①IH時(shí)家兔頸總動脈內(nèi)皮炎癥狀態(tài)及其與瘦素的相互關(guān)系(研究1)；并探討②不同頻率IH/ROX暴露后家兔CB的氧化應(yīng)激、炎癥狀態(tài)、內(nèi)皮素水平和CB竇神經(jīng)(CSN)的傳入活性(研究2)。 材料與方法： 第一部分中由計(jì)算機(jī)程

3、序在細(xì)胞培養(yǎng)艙中產(chǎn)生相應(yīng)的IH或CH暴露條件，將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞可傳代細(xì)胞株ECV304暴露于該條件。①在研究1中，將暴露細(xì)胞株分為間歇正常氧(IN)組，IH組，IH高碳酸組，CH組，CH高碳酸組，CH累加IH組，不同IH程度組，不同IH頻率組和不同IH時(shí)限組。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定培養(yǎng)基中IL-6和TNFα的水平。②在研究2中，將ECV304細(xì)胞株暴露于IH/ROX環(huán)境60次循環(huán)。暴露時(shí)按IH/ROX時(shí)段將細(xì)胞分為11組

4、，每組樣本數(shù)為12。A組：采用21％O215s/21％O23min45s方案(即間歇正常氧)；B組：置于標(biāo)準(zhǔn)孵箱中不加暴露(標(biāo)準(zhǔn)孵育)；C組：采用1.5％O215s/21％O23min45s方案；D組：采用10％O215s/21％O23min45s方案；以下固定IH方案為1.5％O215s和ROX程度21％O2不變，IH/ROX循環(huán)頻率分別為每小時(shí)12次(即為C組)、9.23次(E組)、6.32次(F組)、20次(G組)和40次(H組)

5、；I組：采用1.5％O230s/21％O23min45s方案；C組完成暴露后放回標(biāo)準(zhǔn)孵箱中60min為J組而120min為K組。采用ELISA法和細(xì)胞表面ELISA法測定細(xì)胞裂解液中總NF-κB水平和細(xì)胞表面ICAM-1濃度。③在研究3中，暴露細(xì)胞株分為7組，每組樣本數(shù)n=12，分別為IN組；IH組，CH組(15min和30min兩個(gè)組)；CH累加IH組；IH恢復(fù)組；CH恢復(fù)組。ELISA法測定細(xì)胞中核內(nèi)外NF-κB水平。 第二

6、部分中成年雄性新西蘭大耳白家兔(2.5～3.0kg)游離右側(cè)頒總動脈和CSN，顯露CSN化學(xué)感受性神經(jīng)細(xì)束并安放電極記錄CSN傳入活性。結(jié)扎右側(cè)頸總動脈向心端血流，并向右側(cè)頸總動脈遠(yuǎn)心端內(nèi)插入導(dǎo)管，經(jīng)蠕動輸液泵交替灌注以發(fā)泡法預(yù)平衡IH/CH灌注液。監(jiān)測CSN傳入活性，完成暴露后游離收集CB和插管遠(yuǎn)心端的頸總動脈及其分叉。①研究1中，將60只家兔分為六組，每組10只，分為A.間歇正常氧(IN)組；B.重度IH組；C.輕度IH組；D.重度

7、IH+瘦素組；E.CH組；F.單純瘦素培養(yǎng)組(Lep組)。暴露后剪下遠(yuǎn)端頸總動脈，縱向剖開刮取內(nèi)皮細(xì)胞層。標(biāo)本一部分以非放射性凝膠遷移實(shí)驗(yàn)測定IN組、重度IH組、輕度IH組和CH組核抽提物中核轉(zhuǎn)錄因子κB(NFκB)DNA結(jié)合活性。IN組、重度IH組、重度IH+Lep組和Lep組的另一部分于標(biāo)準(zhǔn)孵箱培養(yǎng)2小時(shí)，培養(yǎng)時(shí)在重度IH+Lep組和Lep組培養(yǎng)孔中加入人重組瘦素(終濃度10ng/ml)。以ELISA法測定培養(yǎng)基中白細(xì)胞介素-6(I

8、L-6)濃度。以逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)測定內(nèi)皮細(xì)胞Ras同源物A(RhoA)mRNA表達(dá)水平。②研究2中，將49只家兔分為7組，每組7只，分為A.間歇正常氧(IN)組；B.IH/ROX頻率為10次/小時(shí)組(10·hr-1組)；C.IH/ROX頻率為30次/小時(shí)組(30·hr-1組)；D.IH/ROX頻率為50次/小時(shí)組(50·hr-1組)；E.IH/ROX頻率為60次/小時(shí)組(60·hr-1組)：F.IH/ROX頻率為90次/小時(shí)組(90

9、·hr-1組)；G.持續(xù)低氧組(CH組)。暴露完成后采集CSN化學(xué)感受性神經(jīng)細(xì)束傳入活性的頻率(ChargeF)，而后游離收集右側(cè)CB，以EIASA法測定CB裂解液中自細(xì)胞介素-6(IL-6)、內(nèi)皮素-1(ET-1)、低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的濃度并標(biāo)化。所有研究均用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)論：第一部分結(jié)論為IH/ROX可對內(nèi)皮細(xì)胞造成具有程度依賴性的炎性損傷，其損傷程度明顯強(qiáng)于CH

10、且不易恢復(fù)，即使IH暴露結(jié)束以后，炎癥反應(yīng)的基礎(chǔ)在相當(dāng)長時(shí)間內(nèi)仍持續(xù)存在，這種IH/ROX損傷在伴有高碳酸暴露時(shí)程度更加嚴(yán)重；IH/ROX對內(nèi)皮細(xì)胞的炎性損傷來源于ROX時(shí)段而非來源于IH時(shí)段，是ROX時(shí)相而非IH時(shí)相導(dǎo)致NFκB總含量增加且核內(nèi)轉(zhuǎn)位，誘導(dǎo)炎癥產(chǎn)生；中度頻率的IH/ROX將選擇性激活細(xì)胞炎性通道，而過高頻率和過長時(shí)段的IH反而激活細(xì)胞適應(yīng)性通道。第二部分結(jié)論為IH/ROX明顯激活內(nèi)皮炎性通道，其作用強(qiáng)于CH且存在程度依賴

11、性。當(dāng)IH/ROX與瘦素共同暴露時(shí)有協(xié)同作用，炎癥反應(yīng)更加明顯，并使內(nèi)皮層通透性增加。IH/ROX暴露后CBCSN傳入活性明顯增強(qiáng)并與CB炎癥和血管收縮密切相關(guān)，CB的炎癥來源于ROX時(shí)段而非來源于IH時(shí)段。這種反應(yīng)將導(dǎo)致高交感神經(jīng)張力，在高血壓發(fā)病中將起至關(guān)重要的作用。這一過程受到IH/ROX頻率的影響。隨著IH/ROX頻率的不斷增加，CB炎癥狀態(tài)、內(nèi)皮素水平和CSN長期易化先是逐漸增加，而后再逐漸下降。而HIF-1和VEGF是IH/