Ad-HGF轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞治療股骨頭缺血壞死的實(shí)驗(yàn)研究及影像學(xué)觀察.pdf

1、研究目的
　　 1.利用腺病毒表達(dá)載體將肝細(xì)胞生長因子轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,用流式細(xì)胞術(shù)檢測基因轉(zhuǎn)染效率,原位雜交及免疫組化檢測轉(zhuǎn)染后外源基因HGF的表達(dá)。
　　 2.建立激素性早期兔股骨頭缺血壞死模型,用CT灌注成像及MRI動(dòng)態(tài)增強(qiáng)進(jìn)行影像學(xué)觀察,探討ANFH影像學(xué)灌注異常與股骨頭血流動(dòng)力學(xué)改變及病理改變的關(guān)系。
　　 3.經(jīng)皮股骨頭穿刺,向兔缺血壞死股骨頭內(nèi)移植轉(zhuǎn)染HGF基因的BMSCs,行CTP、DCE-

2、MRI及病理檢查,探討Ad-HGF轉(zhuǎn)染BMSCs對(duì)改善股骨頭血供、促進(jìn)壞死修復(fù)、骨質(zhì)重建的作用,以及影像學(xué)對(duì)基因治療ANFH的監(jiān)測作用。
　　 材料與方法：
　　 1Ad-HGF轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的制備及體外實(shí)驗(yàn)1.1腺病毒載體Ad-HGF、Ad-GFP的構(gòu)建攜帶HGF基因和報(bào)告基因-綠色熒光蛋白(greenfluorescenceprotein,GFP)的重組腺病毒(adenovirus)載體Ad-HGF、Ad-GF

3、P,均委托本元正陽基因技術(shù)有限公司構(gòu)建。
　　 1.2兔BMSCs的分離培養(yǎng)抽取4周齡純新西蘭大白兔骨髓15ml,離心去除表面上清及脂肪細(xì)胞,加10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)液置于培養(yǎng)箱中接種培養(yǎng),更換培養(yǎng)液時(shí)棄掉懸浮細(xì)胞,待貼壁細(xì)胞長至接近融合時(shí)(2周),胰酶消化,傳代培養(yǎng)至第二代細(xì)胞時(shí)備用。
　　 1.3Ad-GFP轉(zhuǎn)染BMSCs轉(zhuǎn)染效率及表達(dá)持續(xù)時(shí)間的檢測
　　 1.4原位雜交及免疫組化檢測HGF在BMSCs中

4、的表達(dá)以MOI=300的Ad-HGF轉(zhuǎn)染BMSCs,胰酶消化并收集細(xì)胞；將轉(zhuǎn)染后的BMSCs滴加于硅化玻片上,制備細(xì)胞爬片,進(jìn)行原位雜交及免疫組化檢測。
　　 2兔股骨頭缺血壞死模型的建立及影像學(xué)觀察
　　 3Ad-HGF轉(zhuǎn)染BMSCs治療兔股骨頭缺血壞死的初步研究及影像學(xué)觀察
　　 4墨汁灌注及病理動(dòng)物麻醉,手術(shù)暴露并穿刺腹主動(dòng)脈,生理鹽水加壓灌洗,將墨水與右旋糖酐以7:3的比例混合,注入血管約100ml,至雙

5、下肢皮膚、甲床變?yōu)楹谏?。取材、固定、脫鈣、切片,立體顯微鏡觀察股骨頭血管分布。
　　 實(shí)驗(yàn)兔處死后,剖取雙側(cè)股骨頭連同干骺端,固定、脫鈣,石蠟包埋,切片,HE染色,光鏡觀察骨小梁、造血組織的變化。
　　 5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 所有數(shù)據(jù)均以(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,體外實(shí)驗(yàn)中表達(dá)GFP的陽性細(xì)胞率、正常與模型組間CTP各灌注參數(shù)及DCE-MRI最大強(qiáng)化率及最大強(qiáng)化

6、斜率的比較,采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析方法(one-wayANOVA),P<0.05,被認(rèn)為有顯著性差異。
　　 基因治療組、單純穿刺組及自然修復(fù)組之間以及不同治療時(shí)間CTP灌注參數(shù)及DCE-MRI峰值強(qiáng)化率及強(qiáng)化斜率的比較,采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析方法(repeatedmeasures),P<0.05,被認(rèn)為有顯著性差異。
　　 結(jié)果
　　 1.Ad-HGF轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的制備及體外

7、實(shí)驗(yàn)1.1Ad-GFP轉(zhuǎn)染BMSCs轉(zhuǎn)染效率及表達(dá)持續(xù)時(shí)間的檢測Ad-GFP以不同的MOI轉(zhuǎn)染兔BMSCs48h后,表達(dá)GFP的陽性細(xì)胞率有顯著性差異(P<0.05),隨著MOI的增加,表達(dá)GFP的陽性細(xì)胞率逐漸增加,但當(dāng)MOI大于200以上,表達(dá)GFP的陽性細(xì)胞率無顯著性差異(P>0.05)；MOI=300時(shí)表達(dá)GFP的陽性細(xì)胞率達(dá)98％以上,因此選擇MOI=300轉(zhuǎn)染BMSCs。
　　 Ad-GFP以MOI=300轉(zhuǎn)染兔BM

8、SCs后不同時(shí)間,表達(dá)GFP的陽性細(xì)胞率有顯著性差異(P<0.05)。轉(zhuǎn)染后24h即可見GFP表達(dá),2至7天時(shí)表達(dá)最高,7天后顯著下降,28天時(shí)仍可檢測到GFP的表達(dá)。
　　 1.2原位雜交及免疫組化檢測HGF在兔BMSCs中的表達(dá)將Ad-HGF以MOI=300轉(zhuǎn)染兔BMSCs后,原位雜交及免疫組化檢測結(jié)果顯示:細(xì)胞的胞核和胞漿中有棕黃色顆粒性陽性雜交信號(hào),胞漿內(nèi)有豐富的HGF蛋白表達(dá),表明Ad-HGF可高效轉(zhuǎn)染BMSCs,并B

9、MSCs有HGFmRNA及蛋白的高表達(dá)。
　　 2兔股骨頭缺血壞死模型的建立及影像學(xué)觀察2.1CT2.1.1常規(guī)CT模型組兔股骨頭表現(xiàn)較輕,僅可見股骨頭皮質(zhì)模糊,皮質(zhì)下松質(zhì)骨內(nèi)小點(diǎn)狀低密度影,骺線模糊不清,干骺端密度增高。
　　 2.1.2CTPTDC曲線模型3周組兔股骨頭TDC形態(tài)與正常對(duì)照組相似；模型4周組TDC上升段緩慢并幅度減小,波峰更平滑持續(xù)時(shí)間更長；模型5周組TDC呈低平型。
　　 2.1.3CTP灌

10、注參數(shù)比較正常組及模型各組股骨頭BF、BV、PS值均有顯著性差異(P<0.05)。
　　 2.2MRI
　　 2.2.1常規(guī)MRI模型兔股骨頭表現(xiàn)為關(guān)節(jié)積液增多；皮質(zhì)下骨髓中可見小點(diǎn)狀或條狀T2WI高信號(hào)影,以FS-T2WI顯示最清楚；干骺端T2WI高信號(hào)；股骨干骨髓水腫,T2WI及FS-T2WI高信號(hào)。
　　 2.2.2DCE-MRISI-T曲線模型3周組股骨頭SI-T曲線形狀及上升幅度均與正常組接近(約200

11、左右);模型4周組股骨頭SI-T曲線形狀同前,但上升幅度開始降低(約100左右)；模型5周組股骨頭SI-T曲線上升幅度明顯降低,僅上升約50左右。
　　 2.2.3時(shí)間En％曲線及峰值強(qiáng)化情況正常組與模型3周組股骨頭時(shí)間-En％曲線接近,模型4周組曲線下降,模型5周組曲線下降更明顯,曲線最低。
　　 2.3墨汁灌注及病理正常股骨頭HE染色:骨膜光滑,軟骨細(xì)胞排列整齊；骨小梁完整規(guī)則,空骨陷窩少見；骨髓造血細(xì)胞豐富,脂肪細(xì)

12、胞相對(duì)較少。墨汁灌注骨髓腔內(nèi)毛細(xì)血管豐富,形成血管網(wǎng),血管結(jié)構(gòu)清晰。
　　 模型組股骨頭HE染色:軟骨部分脫落,骨小梁稀疏變細(xì),空骨陷窩增多；骨髓腔內(nèi)造血組織明顯減少,細(xì)胞數(shù)目及網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較正常稀疏,脂肪細(xì)胞體積增大,部分融合成泡狀。墨汁灌注顯示股骨頭血管顯著減少,骨髓腔內(nèi)毛細(xì)血管稀疏,灌注不全面。
　　 3Ad-HGF轉(zhuǎn)染BMSCs治療兔股骨頭缺血壞死的初步研究及影像學(xué)觀察3.1CT基因治療組2周時(shí)CTPTDC形態(tài)有不同

13、程度的上升,表現(xiàn)為類似正常股骨頭TDC形態(tài),但上升的幅度較正常略低,約25-30Hu左右；4周時(shí)股骨頭TDC形態(tài)基本與2周時(shí)相似,但上升幅度下降,約20Hu左右。單純穿刺組2周時(shí)股骨頭CTPTDC形態(tài)亦表現(xiàn)類似基因治療組,但上升幅度較低,4周時(shí)曲線上升幅度下降,呈現(xiàn)低平型。自然修復(fù)組CTPTDC曲線形態(tài)呈低平型。
　　 3.2MRI治療2周時(shí),基因治療組與單純穿刺組股骨頭SI-T曲線均有不同程度的上升,但基因治療組較單純穿刺組上

14、升幅度明顯；4周時(shí),基因治療組股骨頭SI-T曲線仍有上升,單純穿刺組股骨頭SI-T曲線上升不明顯。
　　 3.3墨汁灌注及病理基因治療組HE染色見小血管數(shù)目增多,造血細(xì)胞增多,骨小梁成骨活躍,新骨形成,并可見組織的重建和修復(fù)現(xiàn)象；墨汁灌注顯示軟骨下骨小梁內(nèi)的骨髓中血管網(wǎng)增多,小血管較豐富。
　　 結(jié)論
　　 1.Ad-GFP可成功轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,Ad-GFP以MOI=300轉(zhuǎn)染BMSCs,轉(zhuǎn)染率可達(dá)98％以

15、上,24h即可見綠色熒光,2-7天轉(zhuǎn)染率最高,28天仍可見轉(zhuǎn)染。表明重組腺病毒作為載體轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有高轉(zhuǎn)染率與穩(wěn)定表達(dá)。
　　 2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為靶細(xì)胞,來源充足、取材較容易、體外分離培養(yǎng)純化可大量擴(kuò)增,操作性強(qiáng)。
　　 3.原位雜交及免疫組化檢測結(jié)果表明,Ad-HGF可高效轉(zhuǎn)染BMSCs,并有HGFmRNA及蛋白的高表達(dá)。
　　 4.馬血清加激素誘導(dǎo)早期兔股骨頭缺血壞死的成模率及動(dòng)物存活率較高,

16、病理改變主要為空骨陷窩增多,骨髓內(nèi)造血細(xì)胞減少,脂肪細(xì)胞大量聚集,體積增大,壓迫髓內(nèi)血管床造成股骨頭缺血,與ANFH的影像學(xué)表現(xiàn)密切相關(guān)。
　　 5.CT灌注成像及MRI動(dòng)態(tài)增強(qiáng)掃描均能較好反映股骨頭血流動(dòng)力學(xué)改變,可定量觀察ANFH股骨頭微循環(huán)的改變。缺血的股骨頭血流灌注降低,表現(xiàn)為CTP灌注參數(shù)BF、BV及PS降低,TDC峰值強(qiáng)化下降；DCE-MRI間間-強(qiáng)化率曲線下降,En％max及EnR降低,并隨著時(shí)間的延長呈逐漸下降趨

17、勢(shì)。
　　 6.CT灌注成像及MRI動(dòng)態(tài)增強(qiáng)掃描均能較好反映ANFH股骨頭血流動(dòng)力學(xué)改變,可定量監(jiān)測ANFH基因治療后股骨頭微循環(huán)的改變。Ad-HGF轉(zhuǎn)染BMSCs可增加股骨頭血流灌注,表現(xiàn)為股骨頭CTP灌注參數(shù)BF、BV及PS值升高、TDC峰值強(qiáng)化增加；DCE-MRI時(shí)間-強(qiáng)化率曲線上升,En％max及EnR增加。
　　 7.Ad-HGF轉(zhuǎn)染的BMSCs植入ANFH股骨頭后,病理證實(shí)股骨頭血管數(shù)目增多,骨小梁成骨活躍,