硫化氫在大鼠內(nèi)毒素休克發(fā)生發(fā)展中的作用及其對一氧化氮和一氧化碳的影響.pdf

1、內(nèi)毒素休克(endotoxic shock，ES)多由革蘭氏陰性桿菌內(nèi)毒素引起，血管調(diào)節(jié)功能失調(diào)、血管擴(kuò)張引起的低血壓及全身炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的器官組織損傷為其主要的臨床病理過程。內(nèi)毒素主要活性成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可激活或誘發(fā)各種內(nèi)源性炎癥介質(zhì)如補(bǔ)體、激肽及多種細(xì)胞因子，包括腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)

2、和干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)等。以往實(shí)驗(yàn)證明許多炎癥介質(zhì)本身即是血管活性物質(zhì)，是參與休克發(fā)生發(fā)展的主要因素。然而內(nèi)毒素休克時(shí)，循環(huán)衰竭器官組織炎癥性損傷的確切發(fā)病機(jī)制尚未闡明，且在臨床治療上仍是一個(gè)非常棘手的問題。近年來，隨著分子生物學(xué)研究進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)小分子氣體如一氧化氮(nitric oxide，NO)和一氧化碳(carbon monoxide，CO)在休克時(shí)含量增高，對血壓調(diào)節(jié)和血管舒張起重要作用。但內(nèi)毒素休克

3、時(shí)低血壓狀態(tài)發(fā)生的確切機(jī)制仍未完全闡明，大量的研究表明，內(nèi)毒素休克時(shí)嚴(yán)重低血壓的形成并非完全由于此時(shí)大量誘導(dǎo)生成的NO和CO所致，而且NO、CO在內(nèi)毒素休克組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過程中具有“雙面刃”作用。選擇性抑制NO的產(chǎn)生(應(yīng)用誘生型NO合酶抑制劑)能減輕內(nèi)毒素引起的組織炎癥性損傷，而完全抑制NO、CO的產(chǎn)生雖能使內(nèi)毒素休克動物血壓升高，但并未能降低內(nèi)毒素休克動物的死亡率和延長其存活時(shí)間，甚至是相反的結(jié)果。九十年代中葉，人們發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)

4、半胱氨酸代謝過程中生成小分子氣體硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)，對神經(jīng)糸統(tǒng)特別是海馬功能具有調(diào)節(jié)作用，且可以調(diào)節(jié)消化道和血管平滑肌張力，其生物學(xué)作用類似NO和CO。H<,2>S作為內(nèi)毒素休克時(shí)一系列病理生理反應(yīng)中的一種新的內(nèi)源性介質(zhì)，已開始受到人們的重視。目前，內(nèi)源性H<,2>S的生理與病理意義遠(yuǎn)未闡明，其在內(nèi)毒素休克中的病理生理作用研究較少且尚存在爭議。有研究報(bào)道H2S生成增多導(dǎo)致了內(nèi)毒素休克低血壓和組織炎癥性損傷

5、的發(fā)生，抑制H<,2>S產(chǎn)生后可改善低血壓和組織損傷。但也有研究認(rèn)為H2S具有組織保護(hù)作用，如Yuka等認(rèn)為內(nèi)源性H2S可通過增加谷胱甘肽的生成來保護(hù)神經(jīng)元免受氧化損傷；Bian的研究顯示H<,2>S在缺血性心肌損傷中發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用；Fiorucci等人證實(shí)H<,2>S通過改善胃的微循環(huán)可減輕抗炎性非甾體類藥物引起的胃損傷。因此，本研究在建立內(nèi)毒素休克大鼠模型的基礎(chǔ)上，觀察血漿中H<,2>S含量的變化與低血壓、組織炎癥性損傷的關(guān)系，從

6、而證實(shí)H<,2>S在內(nèi)毒素休克時(shí)的確切作用；觀察H<,2>S在內(nèi)毒素休克發(fā)生發(fā)展中的作用與NO、CO的關(guān)系，旨在探討H<,2>S在內(nèi)毒素休克發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制，以期進(jìn)一步揭示內(nèi)毒素休克的發(fā)病機(jī)制。 1 內(nèi)毒素休克大鼠模型的建立內(nèi)毒素休克(endotoxic shock，ES)是一個(gè)以急性微循環(huán)障礙為主的常見臨床危重病癥，死亡率極高。因此，如何防治內(nèi)毒素休克的發(fā)生是重癥醫(yī)學(xué)所關(guān)注并亟待解決的重大課題。在本研究中，我們試圖闡明

7、其發(fā)病機(jī)制，為此需制備較穩(wěn)定的ES動物模型。革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素的主要活性成分脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)是內(nèi)毒素休克的首要原因，本部分實(shí)驗(yàn)通過靜脈注入LPS復(fù)制內(nèi)毒素休克模型。 2 內(nèi)毒素休克大鼠血漿和主要器官中硫化氫含量的變化和意義。 3 硫化氫在內(nèi)毒素休克中的作用與一氧化氮的關(guān)系我們前面的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素休克時(shí)低血壓及此時(shí)由于炎癥導(dǎo)致的組織損傷的部分原因是由于內(nèi)源性H<,2>S生成增多引起

8、的。我們課題組以往的研究發(fā)現(xiàn)，在LPS所致的急性肺損傷模型中，內(nèi)源性H<,2>S生成不足、NO大量產(chǎn)生可能是肺損傷發(fā)生的機(jī)制之一；外源性H<,2>S的抗組織損傷作用可能與其抑制iNOS活性，減少NO的大量產(chǎn)生有關(guān)。但是H<,2>S在內(nèi)毒素休克中的作用與NO有何關(guān)系報(bào)道較少且尚有爭議。 在本部分實(shí)驗(yàn)中我們將組織代謝生成H2S的關(guān)鍵酶[(胱硫醚-γ-裂解酶(Cystathionine γ-lyase，CSE)]的抑制劑炔丙基甘氨酸(

9、propargylglycine，PPG)及外源性H<,2>S供體NaHS應(yīng)用于內(nèi)毒素大鼠，觀察H2S對內(nèi)毒素休克大鼠NOS/NO體系的影響，以探討H<,2>S在內(nèi)毒素休克中的作用與NO的關(guān)系。 4 硫化氫在內(nèi)毒素休克中的作用與一氧化碳的關(guān)系近年來大量的研究表明，內(nèi)毒素休克嚴(yán)重低血壓的形成及組織的炎癥損傷并非完全由于iNOS誘導(dǎo)生成的NO所致，其中血紅素氧合酶-1/一氧化碳(heme oxygenase-1/carbon mon

10、oxide，HO-1/CO)系統(tǒng)作為感染性休克一系列病理生理反應(yīng)中的內(nèi)源性介質(zhì)也已逐漸為人們所重視。我們前面的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素休克時(shí)的低血壓及此時(shí)由于炎癥導(dǎo)致的組織損傷的部分原因是由于內(nèi)源性H<,2>S生成增多引起的。可見，迄今發(fā)現(xiàn)的三種內(nèi)源性氣體信號分子，即NO、CO和H<,2>S均參與了內(nèi)毒素休克的發(fā)生。 第三部分的實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，H<,2>S在內(nèi)毒素休克過程中的作用與NO有關(guān)。那么在此過程中，H2S的作用與HO-1/CO有無聯(lián)

11、系、H<,2>S對HO-1/CO有無作用呢?本部分實(shí)驗(yàn)將觀察內(nèi)毒素休克時(shí)H<,2>S對HO-1/CO的影響。 將64只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為四組：①正常對照組：經(jīng)靜脈注入生理鹽水(1 ml/kg)；②LPS組：經(jīng)靜脈注入LPS(10mg/kg，10mg/ml)；③LPS+硫氫化鈉(NaHS，H2S供體)組：注入LPS前10min經(jīng)腹腔注入NaHS(28μmol/kg，溶于0.5 ml生理鹽水)；④LPS+炔丙基甘氨酸(PP

12、G，H<,2>S代謝酶抑制劑)組：注入LPS前30 min經(jīng)腹腔注入PPG(45 mg/kg，溶于0.5 ml生理鹽水)。于生理鹽水、LPS注入后不同時(shí)間點(diǎn)自股動脈分別留取肝素抗凝的血液(0，30，60，90 min，2，3，4，6 h)和心、肝、脾、肺、腎等主要器官組織(6 h)。測定血液和各組織中CO含量；采用免疫組織化學(xué)和Western blot方法檢測各組織中HO-1蛋白的表達(dá)。 結(jié)論 本研究在建立內(nèi)毒素休克大鼠

13、模型的基礎(chǔ)上從整體和分子水平較為系統(tǒng)地觀察了H2S在內(nèi)毒素休克發(fā)生發(fā)展中的作用及其對NO和CO的影響。探討了}hS在內(nèi)毒素休克發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制，為進(jìn)一步揭示內(nèi)毒素休克的發(fā)病機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 1 通過靜脈注入大劑量LPS的方法成功復(fù)制了內(nèi)毒素休克動物模型。應(yīng)用LPS建立的感染性休克動物模型MAP、心率變化與臨床感染性休克相似，是一個(gè)理想的模型。 2 內(nèi)毒素休克大鼠嚴(yán)重低血壓和組織炎癥損傷的發(fā)生與H<,2>S生成