吲哚美辛對(duì)二氧化硅誘導(dǎo)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞溶菌酶蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、背景與目的：矽肺是由于長(zhǎng)期吸入含有游離二氧化硅(SiO2)粉塵而引起的以肺組織纖維化為主的全身性疾病,我國(guó)矽肺病例約占?jí)m肺總病例50％,是危害最嚴(yán)重的一種塵肺病。矽肺纖維化發(fā)病的分子機(jī)制研究至今雖尚未完全闡明,有研究表明矽肺的發(fā)生與溶酶體酶有關(guān)。吸入的SiO2對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophage,AM)溶酶體的損傷及伴隨的溶酶體酶向胞漿的釋放在矽肺的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。溶菌酶(lysozyme,LSZ)是巨噬細(xì)胞溶酶

2、體中主要的水解酶之一,肺泡巨噬細(xì)胞溶菌酶可能成為一種致纖維化因子,刺激肺組織成纖維細(xì)胞增殖,導(dǎo)致膠原的過量合成和沉積,加速矽肺纖維化的形成。并且有研究表明LSZ比其它溶酶體水解酶更易釋放。所以本實(shí)驗(yàn)采用溶菌酶作為肺泡巨噬細(xì)胞的標(biāo)志酶進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)室前期的工作中,通過免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR的方法證明了矽塵能刺激肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)溶菌酶表達(dá)增加,在此基礎(chǔ)上,我們?cè)O(shè)想在矽肺的發(fā)生發(fā)展過程中,SiO2作用于肺泡巨噬細(xì)胞以后,是否

3、可用某種藥物在細(xì)胞水平和蛋白水平上抑制SiO2誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)溶菌酶的表達(dá)上調(diào),從而減緩對(duì)巨噬細(xì)胞和肺組織的損傷,阻止矽肺纖維化的形成。本實(shí)驗(yàn)研究以溶菌酶作為大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的標(biāo)志酶,應(yīng)用Western Blotting蛋白免疫印跡法對(duì)染矽塵后肺泡巨噬細(xì)胞加入不同濃度吲哚美辛(Indomethacin,IND),觀察SiO2誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞(AM)中溶菌酶蛋白的表達(dá)有無變化,吲哚美辛對(duì)SiO2誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞(AM)中溶菌酶的蛋白

4、表達(dá)有無抑制作用。從蛋白質(zhì)水平探討吲哚美辛對(duì)二氧化硅誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞溶菌酶表達(dá)的影響,以期為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)矽肺發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)分組與方法：
　　本實(shí)驗(yàn)分為二個(gè)部分，
　　1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變:按改良的Myrivk法在無菌條件下進(jìn)行大鼠支氣管肺泡灌洗,灌洗液經(jīng)1500 rpm離心15 min,棄上清,用PBS(phosphate buffer saline,PBS)洗滌一次,合并混勻

5、,加入含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基,放入37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),2 h后用PBS洗滌,洗去雜細(xì)胞和未貼壁的肺泡巨噬細(xì)胞,即得較純的AM。將純化的AM換入不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中,按是否加入SiO2和吲哚美辛處理分為對(duì)照組、模型組和干預(yù)組。干預(yù)組又分為低、中、高三個(gè)劑量依次為10-5g/ml、10-4g/ml、10-3g/ml,分別用IND1、IND2、IND3表示。模型組加入SiO250μg/ml粉塵懸液

6、復(fù)制矽塵中毒模型,干預(yù)組在加入SiO250μg/ml粉塵懸液的同時(shí)加入相應(yīng)濃度的IND;對(duì)照組給予同體積PBS。37℃培養(yǎng)8 h后在倒置顯微鏡上拍攝細(xì)胞圖片。2.Western Blotting蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)將上述處理的肺泡巨噬細(xì)胞(AM)在培養(yǎng)8 h、16 h后收集的細(xì)胞,按分組進(jìn)行蛋白質(zhì)提取。再將所提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行Western Blotting蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn),檢測(cè)LSZ在AM中的表達(dá),并用Quantity One軟件結(jié)合圖像對(duì)

7、LSZ的表達(dá)進(jìn)行半定量分析。結(jié)果1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn):純化并經(jīng)過處理的肺泡巨噬細(xì)胞(AM)在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 h后在倒置顯微鏡下拍照,發(fā)現(xiàn)對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好。模型SiO2組經(jīng)50μg/mlSiO2刺激8h后肺泡巨噬細(xì)胞腫脹變形,并出現(xiàn)細(xì)胞碎片。而干預(yù)組加入吲哚美辛藥物的AM細(xì)胞形態(tài)與模型組相比較細(xì)胞相對(duì)完整,且有濃度依賴趨勢(shì)。
　　2.Western Blotting蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn):經(jīng)50μg/ml SiO2刺激8h、

8、16h后,模型組肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)LSZ蛋白表達(dá)與陰性對(duì)照組相比明顯上調(diào),干預(yù)組加藥后對(duì)SiO2誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)LSZ蛋白表達(dá)均有下降趨勢(shì)。1)模型組AMS在8 h和16 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)溶菌酶(LSZ)蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組,分別是對(duì)照組的1.945、2.285倍,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0125)。2)干預(yù)組在8 h和16 h兩個(gè)時(shí)間LSZ蛋白表達(dá)均低于模型組,在8 h時(shí)間點(diǎn)與模型組比較(分別是對(duì)照組的1.586、1.055、0.86

9、4倍),中、高劑量組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0125);在16 h時(shí)間點(diǎn)LSZ蛋白表達(dá)低于模型組(分別是對(duì)照組的1.544、1.481、0.908倍),與模型組比較僅高劑量組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0125)。
　　結(jié)論：本研究在分析國(guó)內(nèi)外矽肺發(fā)病機(jī)理的基礎(chǔ)上,提出矽塵可誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞溶菌酶蛋白表達(dá)增加的設(shè)想,并通過Western Blotting蛋白免疫印跡法在蛋白水平上證明矽塵可誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞溶菌酶表達(dá)的增加,