Smad2反義寡核苷酸對高糖培養(yǎng)人腎小球系膜細胞分泌纖連蛋白，層粘連蛋白的影響.pdf

1、前言: 糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)的常見而嚴重的慢性并發(fā)癥之一，是導致終末期腎功能衰竭的首要致病原因。DN的發(fā)病機制尚不清楚，大量研究表明多種因素參與了其發(fā)生發(fā)展，其中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)/Smad信號通路在其發(fā)生發(fā)展中起重要作用。TGF-β信號系統(tǒng)是細胞生長和分化的重要

2、調(diào)節(jié)劑，Smads蛋白是TGF-β信號系統(tǒng)細胞內(nèi)的重要轉(zhuǎn)導因子，在TGF-β的刺激下Smads蛋白在核內(nèi)積聚調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。Smad 2是Smads蛋白家族成員之一，它是TGF-β1在細胞內(nèi)特有的作用底物，因此Smad2與TGF-β受體短暫的結(jié)合和磷酸化是Smad復合體在細胞核內(nèi)蓄積所必須，是信號轉(zhuǎn)導的始動因子。 DN主要表現(xiàn)為腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化，DM的高糖狀態(tài)下TGF-β1系統(tǒng)激活，Smad2蛋白可通過轉(zhuǎn)導TGF-

3、β信號促進細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的合成與沉積，使系膜基質(zhì)增多，腎小球毛細血管基底膜增厚，致糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。 纖連蛋白(fibronection，F(xiàn)N)和層粘連蛋白(lamimin，LN)是細胞外基質(zhì)的重要組成成分，本實驗通過給體外常規(guī)培養(yǎng)的人腎小球系膜細胞轉(zhuǎn)染Smad2反義寡核苷酸(oligodeoxynudeotides,ODN),直接抑制Smad2基因的激活，觀察其對FN，LN分

4、泌的影響，探討Smad2在糖尿病腎病中的作用，尋找延緩腎小球硬化的新途徑。 研究對象與方法: 1、材料細胞：人腎小球系膜細胞(美國ScienCell Research Laboratory，編號4200)試劑：細胞完全培養(yǎng)基(美國ScienCell Research Laboratory，編號4201)，Lipofectamine 2000(美國Invitrogen Life Technologies)，Smad2正義、

5、反義寡核苷酸。(上海生工生物工程技術服務有限公司)，F(xiàn)N,LN ELISA試劑盒(上海森雄公司)。 儀器：冰箱，離心機，恒溫箱，顯微鏡，熒光顯微鏡，細胞培養(yǎng)實驗臺等。 2、實驗方法 常規(guī)培養(yǎng)人腎小球系膜細胞，傳代至5～8代用于實驗，給予轉(zhuǎn)染不同劑量及比率的寡核苷酸和脂質(zhì)體,觀察轉(zhuǎn)染效率。此后實驗選用最佳轉(zhuǎn)染效率組轉(zhuǎn)染。 取常規(guī)培養(yǎng)傳代至5～8代人腎小球系膜細胞，分為六組：①高糖組：葡萄糖30mmol/L，

6、②轉(zhuǎn)染Smad2反義ODN組：葡萄糖30mmol/L Smad2反義ODN0.81μg,Lipofectamine 2000 2.0μl，⑧轉(zhuǎn)染Smad2正義ODN組：葡萄糖30mmol/L，Srnad2正義ODN0.8μg,Lipofectamine 2000 2.0μl，④脂質(zhì)體組：葡萄糖30mmol/L，Lipofectamine 2000 2.0μl，⑤正常糖組：葡萄糖5.0mmol/L，⑥甘露醇組：甘露醇25mmol/L.葡萄

7、糖5.0mmol/L。分別取0h、18h、24h、48h、72h培養(yǎng)上清液，ELISA法檢測FN，LN含量。 結(jié)果: 通過實驗觀察發(fā)現(xiàn)ODN的轉(zhuǎn)染效率因ODN和Lipofectamine 2000的劑量和比率不同而不同，其中ODN：Lipofectamine 2000=0.8μg：2.0μl=1：2.5轉(zhuǎn)染率最高。人腎小球系膜細胞經(jīng)高糖培養(yǎng)后LN和FN分泌較正常糖組明顯增加，轉(zhuǎn)染反義ODN組LN和FN分泌明顯減少,轉(zhuǎn)染正

8、義ODN組LN和FN分泌無明顯減少，甘露醇組與正常糖組相比LN和FN分泌相似,脂質(zhì)體組與高糖組LN和FN分泌分泌相似。 結(jié)論: 高糖刺激人腎小球系膜細胞能增加其細胞外基質(zhì)FN和LN的合成和分泌，而Smad2反義ODN能抑制PN和LN的分泌，Smad2正義ODN不能抑制PN和LN的分泌,脂質(zhì)體在其中起到瞬時轉(zhuǎn)染ODN的作用，而對FN和LN的分泌無抑制作用，甘露醇組與高糖組的滲透壓相同，而不引起FN和LN分泌增加，說明刺激人