乙型腦炎病毒強弱毒毒力差異的分子機制研究.pdf

1、乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)是黃病毒科黃病毒屬成員，通過侵害中樞神經系統(tǒng)引發(fā)人和豬、馬、野生水禽等動物的病毒性腦炎，危害嚴重。因JEV具有神經毒力，對減毒活疫苗的安全性擔憂使其仍不能被廣泛接受。尋找JEV基因組中的毒力位點并探索其減毒機制是進一步研究JEV致病機理、研制安全有效的新型疫苗的關鍵。本研究以具有強神經毒力的JEV HEN0701株及其細胞傳代致弱株HEN-10S3為研究對象

2、，利用反向遺傳操作技術，探索導致JEV毒力差異的分子基礎及毒力增強或減弱的分子機制。
　　JEV反向遺傳操作系統(tǒng)的建立因其cDNA克隆在宿主菌中所具有的“遺傳不穩(wěn)定性”而受到阻礙。為了建立穩(wěn)定的JEV全長感染性cDNA克隆，我們以HEN0701株基因組中極易發(fā)生突變的5’端序列區(qū)段(nt1-2913)為研究對象，利用軟件尋找影響病毒cDNA穩(wěn)定性的相關序列，驗證該序列對病毒cDNA克隆穩(wěn)定性的影響，并對其進行定點突變和原核啟動子活

3、性的測定。結果發(fā)現(xiàn)，JEV基因組nt54-120較高的原核啟動子活性和JEV結構基因在宿主菌中的表達共同導致了JEV cDNA克隆在E.coli中難以穩(wěn)定增殖。于基因組nt1275與nt1600之間截斷E基因可以穩(wěn)定cDNA克隆。于nt90做A-C突變雖可降低原核啟動子活性，但不能穩(wěn)定克隆。室溫(25 ℃)培養(yǎng)轉化菌，nt54-120的原核啟動子活性有效降低，明顯提高了2913-nt cDNA克隆在宿主菌中的遺傳穩(wěn)定性。因此，低溫培養(yǎng)轉

4、化菌是提高黃病毒cDNA克隆在宿主菌中遺傳穩(wěn)定性的有效方法。
　　以低溫培養(yǎng)轉化菌為基本前提，我們將HEN-10S3基因組全長分為相互重疊的四段，并在第一段5’端加上NotI酶切位點和T7啟動子序列，在第四段3’末端加上HDV核酶序列和XhoI酶切位點。利用四條片段重疊序列以及 pBR322M載體序列中合適的酶切位點，將四條片段于pBR322M中依次拼接成全長cDNA，構建HEN-10S3全長cDNA克隆pBAHC。經過體外轉錄并

5、轉染 BHK-21細胞，獲得拯救病毒 vAHEN。經鑒定，拯救病毒與親本毒在體外生長特性和對小鼠神經毒力兩方面都具有相似特性。克隆pBAHC具有較好的穩(wěn)定性且易于操作，連同本實驗早期構建的HEN0701感染性克隆pJEHEN，為進一步深入研究JEV毒力差異提供了關鍵的技術平臺。
　　以HEN0701和HEN-10S3全長感染性cDNA克隆為基礎，將兩病毒5’-UTR和結構蛋白編碼區(qū)序列（5’UTR-C-PrM-E）互換。分別構建了

6、以HEN0701基因組為骨架嵌合克隆JE-H/5’-CPrME(S)和以 HEN-10S3基因組為骨架的嵌合克隆 JE-S/5’-CPrME(H)，并拯救出嵌合病毒vJE-H/5’-CPrME(S)和 vJE-S/5’-CPrME(H)。對3w小鼠的毒力測試結果顯示，與親本毒相比，嵌合病毒神經毒力發(fā)生顯著變化。vJE-S/5’CPrME(H)毒力明顯上升，表現(xiàn)出強毒特性；而vJE-H/5’CPrME(S)毒力顯著下降，表現(xiàn)出弱毒特性。說

7、明所替換序列對病毒毒力存在重要影響。由于在該序列中僅存在E蛋白第138位氨基酸(E-138 Glu/Arg)一個位點的差異，說明E-138位點可能是影響病毒神經毒力的關鍵位點。
　　利用PCR定點突變技術，將HEN0701 E-138 Glu(E)分別突變?yōu)樗嵝园被酇sp(D)，堿性氨基酸Arg(R)和Lys(K)及中性氨基酸Phe(F)、Ala(A)和Gln(Q)。將HEN-10S3 E-138 R突變成E-138 E。并拯救

8、突變病毒vHE138D、vHE138R、vHE138K、vHE138F、vHE138A、vHE138Q和vSE138E。突變病毒對3w小鼠的毒力測試結果顯示，vHE138D和vSE138E具有強神經毒力；vHE138R和vHE138K無神經毒力；vHE138F、vHE138A和vHE138Q具有一定的神經毒力，介于之間。說明E-138確實是影響JEV神經毒力的關鍵位點，且毒力的強弱與該位點的酸堿性質有關。
　　利用生物信息學軟件分

9、析HEN0701 E蛋白結構，發(fā)現(xiàn)E蛋白E-138與E-47位氨基酸在空間結構上相鄰，以氫鍵相連，但連接方式隨毒力不同而不同。為了研究 E-47對病毒毒力的影響及其與E-138之間的關系，將HEN0701 E-47位Asn(N)分別突變?yōu)樗嵝园被酇sp(D)、堿性氨基酸Lys(K)和中性氨基酸Ala(A)，拯救出突變病毒vHE47D、vHE47K和vHE47A。其對小鼠的毒力測試結果顯示，vHE47D具有強神經毒力；vHE47K無神經

10、毒力；vHE47A神經毒力介于之間。說明JEV E蛋白第47位氨基酸是能夠影響病毒神經毒力的潛在毒力位點，且病毒毒力與該位點氨基酸的酸堿性質有關。根據(jù)本研究中所構建的14種重組病毒毒力差異與兩位突變位點酸堿性質之間的關系，發(fā)現(xiàn) E-47與E-138位氨基酸的酸堿性質共同決定了病毒的神經毒力，酸性越強則毒力越強，當兩個位點同時為酸性氨基酸時，病毒毒力最強。
　　綜上所述，本研究通過一系列試驗發(fā)現(xiàn)在低溫培養(yǎng)轉化菌可以有效提高黃病毒cD