改良鈦支架人工角膜的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 研究與評估改良鈦支架人工角膜的生物相容性和角膜生物愈合的過程；探討制作這種新型人工角膜的方法。體內(nèi)實驗觀察改良后其生物相容性是否增加，觀察臨床表現(xiàn)和并發(fā)癥，并取材檢測MMP-2、TIMP-2在兔角膜組織的表達，探討角膜溶解并發(fā)癥的機理，為臨床治療提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.設計及制備改良鈦支架人工角膜；采用噴砂(SB)工藝預處理人工角膜鈦支架，使其表面變粗糙，然后用酸堿兩步法在人工角膜鈦支架

2、表面快速沉積羥基磷灰石(HA)涂層，改良的人工角膜鈦支架(HA/SB-Ti)外型由二襻改為三襻。采用美國Lambda Research Corporation開發(fā)的光學設計軟件OSLO，按照幾何光學原理設計人工角膜的鏡柱，用聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate PMMA)為原料按設計好的圖紙手工磨制。XRD和SEM分析涂層成分、表面形貌。
　　 2.將18只正常新西蘭白兔及18只新西蘭白兔角膜堿燒傷模

3、型隨機分為3組，其中1組、2組右眼角膜基質(zhì)層內(nèi)分別植入人工角膜支架HA/SB-Ti、SB-Ti，第3組僅做角膜板層切口而不植入支架為手術對照組，另取兩只正常白兔作空白對照。術后裂隙燈觀察角膜水腫及新生血管產(chǎn)生情況，同時觀察支架的存留時間和并發(fā)癥。術后1個月、3個月取材，石蠟包埋后，行HE染色光鏡下觀察支架與組織界面愈合情況；2.5％戊二醛內(nèi)固定后，透射電鏡觀察支架植入后對角膜組織的影響；支架取出后，SEM觀察材料表面組織貼附情況及HA涂

4、層存留情況。
　　 3.二期植入改良鈦支架人工角膜鏡柱，觀察人工角膜植入后臨床反應及并發(fā)癥，于1個月、3個月取材，石蠟包埋后，行免疫組織化學檢測MMP-2、TIMP-2在不同組別的表達；RT-PCR檢測MMP-2、TIMP-2 mRNA在不同時間點的表達；免疫印跡法(Western blot)檢測MMP-2、TIMP-2mRNA產(chǎn)物在不同時間點的表達。
　　 結果：
　　 1.支架經(jīng)噴砂工藝后表面變粗糙，浸入SC

5、S溶液中，表面沉積了致密的羥基磷灰石涂層，涂層由疏松的片狀外層及密集的內(nèi)層組成。酸堿兩步法處理噴砂后的樣品避免了機械打磨，其形狀保持良好，且其表面涂層晶體尺寸大，生長充分，外型的三襻結構及表面的涂層均增加了支架的表面積，使支架與組織的界面變大，增加了支架的牢固性。改良人工角膜鏡柱的直徑為3.2mm、厚度為3.8 mm、前表面曲率半徑為8.874 mm。
　　 2.臨床觀察：人工角膜支架植入術后均不同程度地出現(xiàn)角膜水腫和新生血管。

6、角膜水腫于術后1周內(nèi)逐漸消退，有一例植入SB-Ti支架堿燒傷模型出現(xiàn)角膜溶解的并發(fā)癥。術后1個月、3個月取材，組織學檢查見HA/SB-Ti組界面處成纖維細胞數(shù)多于SB-Ti組，術后1個月時材料/組織界面處仍有炎癥細胞存在。拉出試驗測定HA/SB-Ti支架植入角膜3月后的剪切力較SB-Ti支架增強(P<0.05)。SEM檢查見：鈦支架被細胞外基質(zhì)包裹，HA/SB-Ti支架表面有一層致密物質(zhì)存在，細胞外基質(zhì)在HA表面伸展良好，與HA貼附緊密

7、，而SB-Ti組支架細胞附著量明顯少。堿燒傷植入支架組中支架表面沉著的細胞外基質(zhì)少于正常角膜植入支架組。TEM檢查見：HA/SB-Ti支架與SB-Ti支架植入術后，支架周圍的膠原纖維束紊亂，角膜基質(zhì)有大量成纖維細胞，HA/SB-Ti組角膜越靠近支架中心的成纖維細胞核越圓，核仁清晰，胞漿豐富，代償增強.堿燒傷模型組角膜基質(zhì)中膠原纖維出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，較正常兔角膜組愈合延遲。
　　 3.人工角膜鏡柱二期植入后，3周后結膜充血、角膜水腫癥

8、狀消失，植入改良鈦支架人工角膜的動物未出現(xiàn)角膜溶解等并發(fā)癥，1月、3月各組取材，做免疫組織化學檢查，堿燒傷模型HA/SB-Ti支架植入組1月、3月MMP-2表達的平均光密度較SB-Ti支架植入組有統(tǒng)計學差異(P<0.01)；而3月時TIMP-2表達的平均光密度HA/SB-Ti支架較SB-Ti支架無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；正常動物模型HA/SB-Ti支架植入組1月、3月MMP-2、TIMP-2表達的平均光密度較SB-Ti支架植入組表達

9、弱，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；于2周、1月、3月、5月取材后，做RT-PCR、Western blot檢測，MMP-2mRNA及MMP-2mRNA表達產(chǎn)物從支架植入開始升高，1月達到高峰，然后開始下降，除2周與3月MMP-2mRNA表達產(chǎn)物比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)外，其余各組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而TIMP-2mRNA及TIMP-2mRNA表達產(chǎn)物則開始有波動，然后逐漸升高，各組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

10、
　　 結論：
　　 1.改良的人工角膜支架增加了表面的空隙率和表面積，增強了人工角膜在角膜中的固定。
　　 2.與單純噴砂Ti支架相比，改良的支架增加了兔角膜基質(zhì)成纖維細胞在其表面的粘附、伸展、增殖和分化的能力，促進了材料與組織界面的愈合，更適應角膜的微環(huán)境。
　　 3.改良人工角膜鈦支架的活性鱗片狀表面對抑制角膜組織中MMP-2過度表達與激活有積極作用，MMP-2、TIMP-2的表達在改良鈦支架人工角