神經(jīng)生長因子基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其在神經(jīng)干細(xì)胞中表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：阿爾茨海默病(AD)，也稱老年性癡呆，是一種以進(jìn)行性學(xué)習(xí)記憶能力減退和認(rèn)知功能障礙為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，伴有不同程度的運(yùn)動、語言和人格等多方面的異常。目前，我國正步入老齡化社會，老年人口不斷增多，AD患者越來越多。但由于AD發(fā)病機(jī)制未明，目前尚無有效的治療方法，給家庭、社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。因此，尋找有效的AD治療方法已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)界的迫切課題。 神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTFs)是由靶細(xì)胞分泌的一組特異性蛋白分子，有促進(jìn)和

2、維護(hù)神經(jīng)元生長、存活、分化和執(zhí)行功能的作用。神經(jīng)生長因子(NGF)是最重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一，對神經(jīng)細(xì)胞的生長、增殖、分化、存活以及凋亡，具有重要的作用。在正常腦內(nèi)，皮質(zhì)和海馬產(chǎn)生的NGF逆向運(yùn)輸?shù)交浊澳X，作用于膽堿能神經(jīng)元的NGF受體(NGFR)，能提高膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶ChAT水平，防止膽堿能神經(jīng)元萎縮，促進(jìn)膽堿能神經(jīng)元存活，增加存活膽堿能神經(jīng)元的功能，提高學(xué)習(xí)記憶。動物實(shí)驗(yàn)顯示，腦室內(nèi)灌注NGF，可使AD模型鼠基底前腦膽堿能神經(jīng)元7

3、0％-90％維持存活。NGF為生物大分子，靜脈給藥不能透過血腦屏障，直接腦內(nèi)注射，不僅可能損傷腦組織，帶來感染風(fēng)險，還容易引起雪旺細(xì)胞、感覺和交感神經(jīng)元異常增生等副作用。因而，選擇適當(dāng)?shù)慕o藥途徑，成為目前需要解決的重大課題?；蜣D(zhuǎn)染是目前能提供長期療效的治療方法，基因修飾的細(xì)胞腦內(nèi)移植現(xiàn)已成為研究的重點(diǎn)。 近年來，神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)移植、轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞載體和損傷修復(fù)材料，利用神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行移植治療，或通過病毒載

4、體將目的基因?qū)肷窠?jīng)干細(xì)胞，為神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變和神經(jīng)損傷的臨床治療帶來新的曙光。NSCs能夠不斷分裂增殖、具有多分化潛能，可以分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，在體內(nèi)可以根據(jù)不同腦區(qū)的微環(huán)境分化成該區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞。這種新的細(xì)胞具有以下優(yōu)點(diǎn)：①NSCs在腦中能根據(jù)其周圍微環(huán)境的誘導(dǎo)而分裂，分化成相應(yīng)的細(xì)胞類型，其形態(tài)和功能與附近的宿主細(xì)胞非常類似，因而能部分補(bǔ)償損傷和死亡細(xì)胞的功能；②中樞神經(jīng)系統(tǒng)具備特殊的結(jié)構(gòu)——血腦屏障，這使得淋巴細(xì)胞在正常

5、情況下很難進(jìn)入，因此不同個體之間，甚至是不同物種之間的NSCs移植都幾乎沒有排異反應(yīng)，大大拓寬了NSCs的來源；③NSCs可以在體外根據(jù)不同的需要導(dǎo)入相應(yīng)的外源基因，成為一種廣譜的細(xì)胞載體。采用NGF基因修飾NSCs，不僅可利用它對各種神經(jīng)元的營養(yǎng)作用，而且可利用它維持NSCs的存活，促進(jìn)NSCs分化，使NSCs移植腦內(nèi)后能更大限度地補(bǔ)償損傷和死亡的神經(jīng)元，達(dá)到緩解和改善AD癥狀的目的。 目前常用的轉(zhuǎn)基因載體包括一些病毒載體(如

6、腺病毒等)和陽離子脂質(zhì)體等，它們各有不同的特點(diǎn)，目前在轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中適于作為短時期表達(dá)研究。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體由于其結(jié)構(gòu)和生命周期的原因，并由于已經(jīng)除去了病毒復(fù)制所必須的包裝順序而不能復(fù)制，只能借助逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞，能穩(wěn)定地將外源基因插入和整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，并隨細(xì)胞分裂而傳代，提供了一個高效的、穩(wěn)定的、長期的目的基因轉(zhuǎn)移手段，適于作為基因轉(zhuǎn)染的載體。 本研究采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法從大鼠海馬組織總RNA擴(kuò)增N

7、GF基因，構(gòu)建含NGF基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，將重組體導(dǎo)入神經(jīng)干細(xì)胞，并進(jìn)行NGF表達(dá)的檢測及其生物活性鑒定，為探討NSCs基因治療AD動物模型奠定基礎(chǔ)。 結(jié)論： 1．構(gòu)建了神經(jīng)生長因子逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLEGFP-NGF。 2．構(gòu)建了NGF基因修飾的神經(jīng)干細(xì)胞。 3．基因修飾的神經(jīng)干細(xì)胞能表達(dá)NGF 且具有良好的生物學(xué)活性。 4．神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)的NGF能促進(jìn)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)