自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)急性心肌梗死家兔Ryanodine受體和其穩(wěn)定蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),心臟移植修復(fù)急性心肌梗死后心肌組織是目前醫(yī)學(xué)研究熱點(diǎn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究發(fā)現(xiàn)。BMSCs心臟移植能夠抑制急性心肌梗死后的心室重構(gòu),改善心臟功能,但是移植到體內(nèi)的BMSCs具體存活情況、分化成心肌細(xì)胞的程度和分化的心肌細(xì)胞與原心肌組織的連接關(guān)系等問(wèn)題目前并不完全清楚,BMSCs移植治療缺血性心衰是通過(guò)移植細(xì)胞分化為新生心肌細(xì)胞還是移植細(xì)胞

2、旁分泌作用及其確切機(jī)制這些問(wèn)題也不十分明了。Ryanodine受體(Ryanodine receptor,RyR2)是肌漿網(wǎng)上主要鈣離子釋放通道,在心肌的興奮-收縮藕聯(lián)過(guò)程中具有重要作用。目前研究還認(rèn)為RyR2的穩(wěn)定蛋白FKBP12.6在調(diào)控RyR2通道的作用中最為重要。當(dāng)FKBP12.6與RyR2結(jié)合時(shí),RyR2能穩(wěn)定的處于關(guān)閉狀態(tài);當(dāng)FKBP12.6與RyR2解離時(shí),RyR2通道就處于開(kāi)放狀態(tài),肌漿網(wǎng)內(nèi)的鈣離子就釋放入胞漿。此外,F

3、KBP12.6還參與調(diào)節(jié)相鄰的RyR2同步開(kāi)放和關(guān)閉。研究發(fā)現(xiàn),心衰時(shí),心肌細(xì)胞RyR2和FKBP12.6表達(dá)下降,RyR2結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生異常引發(fā)RyR2鈣滲漏增加,使肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣貯存減少,收縮期肌漿網(wǎng)釋放鈣減少,導(dǎo)致心肌收縮力減弱,心功能降低。另外,RyR2鈣釋放通道數(shù)量減少,還進(jìn)一步減少心肌收縮期肌漿網(wǎng)鈣釋放量,加重心肌收縮力降低,使心衰加重。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是目前國(guó)內(nèi)分子生物研究中的新方法,比半定量PCR檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性高。因此,我

4、們實(shí)驗(yàn)通過(guò)BMSCs心臟移植修復(fù)急性心肌梗死后心肌,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)心肌RyR2和FKBP12.6 mRNA,研究BMSCs心臟移植治療缺血性心力衰竭的機(jī)制。
　　 目的:通過(guò)密度梯度離心法和貼壁法獲得BMSCs,觀察自體BMSCs心臟移植對(duì)心肌梗死家兔心肌Ryanodine受體和其穩(wěn)定蛋白(FKBP12.6)表達(dá)的影響及經(jīng)5-氮胞苷誘導(dǎo)后體外培養(yǎng)4周的BMSCs的超微結(jié)構(gòu),探討B(tài)MSCs心臟移植治療缺血性心力衰竭

5、的機(jī)制。
　　 方法:將30只新西蘭白兔隨機(jī)分為三組:對(duì)照組(只開(kāi)胸但不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支)、AMI組(開(kāi)胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支)和BMSCs組(開(kāi)胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支加BMSCs移植)。采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支的方法制備急性心肌梗死動(dòng)物模型。利用密度梯度離心法和貼壁法獲得BMSCs,經(jīng)5-氮胞苷誘導(dǎo)后,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)標(biāo)記。當(dāng)家兔AMI模型制備后的第10天時(shí),在BMSCs組,將600μl DAPI標(biāo)記的1

6、.0×107個(gè)BMSCs懸液用微量注射器分別按4點(diǎn)直接注入梗死灶邊緣區(qū)域;在AMI組,注射等體積的無(wú)血清DMEM液。在移植后4周時(shí),利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)梗死邊緣區(qū)RyR2和FKBP12.6 mRN,A表達(dá)。采用超聲觀察術(shù)前及術(shù)后左心室射血分?jǐn)?shù)(INEF)的變化。利用倒置顯微鏡觀察BMSCs的生長(zhǎng)形態(tài);用熒光顯微鏡觀察DAPI標(biāo)記的移植細(xì)胞在體內(nèi)的存活情況;利用透射電鏡觀察經(jīng)5-氮胞苷誘導(dǎo)后體外培養(yǎng)4周的BMSCs超微結(jié)構(gòu)。

7、采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,均數(shù)比較采用LSD檢驗(yàn),相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:通過(guò)密度梯度離心法和貼壁法獲得BMSCs形態(tài)均一,純度較高。BMSCs經(jīng)5-氮胞苷誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)變長(zhǎng),體積增大,增殖速度減慢,大約14天左右能見(jiàn)到趨于融合的多核細(xì)胞結(jié)構(gòu)。透射電鏡觀察經(jīng)5-氮胞苷誘導(dǎo)4周的BM

8、SCs為BMSCs和肌細(xì)胞特點(diǎn)間的過(guò)渡類(lèi)型細(xì)胞,可見(jiàn)到微肌絲樣結(jié)構(gòu),但是未發(fā)現(xiàn)肌小節(jié)樣結(jié)構(gòu)。心臟超聲檢查,在AMI前,三組間家兔的左室血分?jǐn)?shù)(LVEF)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在AMI后7天時(shí),對(duì)照組、AMI組和BMSCs組的LVEF分別為67.88±3.91％;53.63±3.38％;51.50±3.51％(F=48.836,P=0.0001),AMI組和BMSCs組的LVEF值比對(duì)照組降低,差別有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AMI組

9、和BMSCs組的組間LVEF值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在BMSCs心臟移植后4周時(shí),與AMI組比較,BMSCs組的LVEF有顯著改善(F=42.769,P=0.0001)。用熒光顯微鏡可觀察到BMSCs移植組心肌內(nèi)有DAPI標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞。GAPDH、RyR2和FKBP12.6的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線和溶解曲線說(shuō)明心肌組織中均有GAPDH、RyR2和FKBP12.6 mRNA的表達(dá)。與對(duì)照組比較,AMI組梗死邊緣區(qū)心肌的RyR2 mRNA

10、和FKBP12.6 mRNA表達(dá)量減少,分別減少1.97倍(P＜0.05)和減少4.41倍(P＜0.05);與AMI組比較,BMSCs組RvR2 mRNA增加1.81倍(P＜0.05),FKBP12.6mRNA增加2.75倍(P＜0.05),LVEF與RyR2和FKBP12.6mRNA均具有正相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)r分別為0.824和0.778,P均＜0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,決定系數(shù)R2分別為0.679和0.606。
　　 結(jié)論:經(jīng)5