肝癌干細胞分離和穩(wěn)定培養(yǎng)體系的建立及化療藥物對其作用.pdf

1、背景：全球腫瘤發(fā)病率呈逐漸增高趨勢，嚴重威脅人類生命。消化系統(tǒng)腫瘤，如肝癌，胃癌，食管癌，結直腸癌，胰腺癌等發(fā)病率在全球范圍內也始終居高不下 。傳統(tǒng)的手術及放化療等手段對腫瘤治療療效有限，而且腫瘤的復發(fā)與轉移也是治療難點，因此積極探索腫瘤治療的新方法有極其重要的意義。
　　 近年來腫瘤干細胞成為腫瘤研究熱點，腫瘤干細胞是一群存在于一些腫瘤組織中數(shù)目極少的干細胞樣細胞，具有自我更新和無限分化潛能，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)、轉移和耐藥

2、的根源 。目前主要通過細胞表面標志物來識別腫瘤干細胞。
　　 研究腫瘤干細胞的首要問題就是分離純化，以及建立穩(wěn)定培養(yǎng)體系。另外，腫瘤干細胞對放化療不敏感，造成腫瘤治療的難點。本課題選擇發(fā)病率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中排名第二的肝癌，進行肝癌干細胞的分離純化并穩(wěn)定培養(yǎng)，以此探索消化道腫瘤干細胞分離及建立穩(wěn)定培養(yǎng)體系的方法，并觀察化療藥物對腫瘤干細胞的作用，為今后腫瘤干細胞研究以及腫瘤靶向治療奠定基礎。
　　 第一部分肝癌干細胞的

3、分離和鑒定
　　 目的：利用肝癌腫瘤干細胞表面標志物來分離腫瘤干細胞,為腫瘤干細胞穩(wěn)定培養(yǎng)體系的建立打下基礎。方法：選取肝癌細胞株SMMC-7721，用免疫磁珠的方法分選表達CD133 的細胞，并通過流式細胞檢測分選的純度，分選后的細胞進行一段時間的培養(yǎng)后再檢測其表面標志物的表達情況。結果：分選后通過流式檢測陽選細胞CD133 表達量為48.73％，陰選細胞CD133 表達量為0.81％，分選后的細胞繼續(xù)培養(yǎng)一周以后，陽選細胞C

4、D133 表達下降，而陰選細胞無改變。結論：利用CD133 作為腫瘤干細胞表面標志，成功分離肝癌細胞株SMMC-7721 中的腫瘤干細胞群體。
　　 第二部分肝癌腫瘤干細胞與非腫瘤干細胞體內外增殖能力的比較
　　 目的：比較肝癌細胞株SMMC-7721 的CD133+和CD133-亞群的生物學特性，通過體外增殖能力、體內成瘤能力來證明CD133+亞群細胞更具有腫瘤干細胞樣的特性。方法：通過平板克隆形成試驗比較SMMC-7

5、721細胞CD133+和CD133-亞群的體外增殖能力，通過裸鼠成瘤試驗比較兩個亞群的體內成瘤能力。結果：分別將500 個CD133+和CD133-單細胞接種培養(yǎng)，兩周后計算克隆形成率CD133+大于CD133-細胞，差異具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）；將106 個CD133+和CD133-細胞接種在裸鼠皮下，四周后觀察成瘤情況并測量瘤體大小，CD133+細胞體內成瘤能力明顯大于CD133-細胞，差異具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。結論

6、：肝癌細胞株SMMC-7721 的CD133+亞群體外增殖能力和體內成瘤能力均大于CD133-亞群，CD133+亞群更具有腫瘤干細胞樣特性。
　　 第三部分抗腫瘤藥物對肝癌腫瘤干細胞和非腫瘤干細胞抑制作用的比較
　　 目的：比較抗腫瘤藥物對肝癌SMMC-7721 細胞CD133+和CD133-亞群的抑制作用。方法：選用經(jīng)典的抗腫瘤藥物5-FU,采用CCK-8 法在藥物作用48 小時后檢測OD 值，并計算藥物對細胞的抑制率