以方測證探討NAFLD中醫(yī)證治特點(diǎn)及演變規(guī)律的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：近年來隨著人民生活水平的提高，非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfatty livet disease NAFLD)患者日益增多．NAFLD主要包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝硬化三種病理類型。目前尚無防治NAFLD的理想藥物，中醫(yī)藥具有一定的優(yōu)勢。在NAFLD發(fā)病過程中的不同階段，中醫(yī)的病機(jī)不同。導(dǎo)師盛國光教授在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，痰濕阻滯、瘀血阻絡(luò)為NAFLD的基本病機(jī)，但在NAFLD發(fā)病過程中的不同階段，其病機(jī)又

2、略有差異，NAFLD早期的病機(jī)多伴有肝郁脾虛；后期的病機(jī)則多伴有濕郁化熱、肝腎不足。導(dǎo)師盛國光教授根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)針對NAFLD病機(jī)的差異分別擬用不同的治法，在臨床上取得了較好的療效。本課題在前期研究有效治法組方的基礎(chǔ)上，采用國內(nèi)外公認(rèn)的NAFLD大鼠模型，觀察中醫(yī)各治法對NAFLD大鼠血清生化、脂肪酸代謝、炎性因子、脂質(zhì)過氧化、肝臟病理、線粒體細(xì)胞色素氧化酶基因表達(dá)等指標(biāo)變化的影響，探討NAFLD的發(fā)病機(jī)制及中醫(yī)的證治特點(diǎn)和病機(jī)演變規(guī)律。

3、 方法：實(shí)驗(yàn)分三部分進(jìn)行： 第一部分：非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠模型的建立及不同的中醫(yī)治法在NAFLD不同時(shí)段對大鼠血清生化指標(biāo)、肝組織病理等的影響(實(shí)驗(yàn)1-2)SPF級(jí)Wistar大鼠80只，隨機(jī)分為5組，每組16只：正常組、模型組、對照藥物治療組(功效為活血化瘀、化痰利濕)、藥物A方治療組(功效為疏肝健脾、活血化瘀、化痰利濕)、藥物B方治療組(功效為化痰消瘀、清熱利濕、補(bǔ)益肝腎)。采用高脂飲食(普通飼料加1

4、5％豬油、2％膽固醇、5％蛋黃粉)復(fù)制NAFLD大鼠模型。分別在實(shí)驗(yàn)第8、12周時(shí)，每組隨機(jī)取8只大鼠，取血清，留取肝臟做指標(biāo)檢測。用全自動(dòng)生化分析儀檢測大鼠血清甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，放免法檢測腫瘤壞死因子-α，計(jì)算肝指數(shù)，按試劑盒操作說明檢測各組大鼠肝組織超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量、還原型谷胱甘肽含量、血清游離脂肪酸，肝組織HE染色，光學(xué)顯微鏡下評(píng)估肝組織脂肪變性和炎癥活動(dòng)程度。

5、第二部分：以方測證探討NAFLD的中醫(yī)證治特點(diǎn)及不同治法對NAFLD脂質(zhì)代謝、肝臟功能、胰島素抵抗指數(shù)及肝組織病理等各項(xiàng)指標(biāo)的影響(實(shí)驗(yàn)3-5)SPF級(jí)Wistar大鼠72只，雌雄各半，隨機(jī)分為9組，每組8只：正常組、模型組、對照藥物治療組、藥物A方治療組、藥物B方治療組、4-8周用A方，8-12周用B方治療組、4-8周用B方，8-12周用A方治療組、先空白，第8-12周用A方治療組、先空白，第8-12周用B方治療組。采用高脂飲食復(fù)制N

6、AFLD大鼠模型。用全自動(dòng)生化分析儀檢測大鼠血清甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、總膽紅素、胰島素含量、胰島素抵抗，放免法檢測腫瘤壞死因子-α，計(jì)算肝指數(shù)，按試劑金操作說明檢測各組大鼠肝組織超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量、還原型谷胱甘肽含量、血清游離脂肪酸，肝組織HE染色，光學(xué)顯微鏡下評(píng)估肝組織脂肪變性和炎癥活動(dòng)程度。 第三部分：肝線粒體在NAFLD中的病理改變、基因表達(dá)及

7、中醫(yī)多法干預(yù)的影響(實(shí)驗(yàn)6-7)SPF級(jí)wistar大鼠40只，隨機(jī)分為5組，每組8只：正常組、模型組、對照藥物治療組、藥物A方治療組、藥物B方治療組。采用高脂飲食復(fù)制NAFLD大鼠模型。取大鼠肝組織進(jìn)行電鏡檢測，采用RT-PCR法檢測大鼠肝線粒體細(xì)胞色素氧化酶基因COX Ⅱ、Ⅲ的表達(dá)，采用Western-blot技術(shù)檢測各組大鼠肝線粒體細(xì)胞色素氧化酶COX Ⅰ蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果： 第一部分：非酒精性脂肪性肝病(NA

8、FLD)大鼠模型的建立及不同中醫(yī)治法在NAFLD不同時(shí)段對大鼠血清生化指標(biāo)、肝組織病理等的影響(實(shí)驗(yàn)1-2)成功建立大鼠NAFLD模型。1.實(shí)驗(yàn)第8周時(shí)，藥物A方組降低NAFLD大鼠血清AST、ALT、TG、TCH、FFA、LDL、TNF-α水平、肝組織MDA含量；提高肝組織SOD、GSH-ST含量的療效顯著優(yōu)于其他治療組(P<0.05或P<0.01)。在病理影響方面，藥物A方組減輕肝細(xì)胞脂肪變、降低炎癥活動(dòng)度的療效與其他治療組相比有顯

9、著性差異(P<0.05或P<0.01)。2.實(shí)驗(yàn)第12周時(shí)，藥物B方組降低NAFLD大鼠血清AST、ALT、FFA、TNF-α水平、肝指數(shù)、肝組織MDA含量；提高肝組織SOD、GSH-ST含量的療效顯著優(yōu)于其他治療組(P<0.05或P<0.01)。在病理影響方面，藥物B方組減輕肝細(xì)胞脂肪變、降低炎癥活動(dòng)度的療效與其他治療組相比有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。 第二部分：以方測證探討NAFLD的中醫(yī)證治特點(diǎn)及不同治法對

10、NAFLD脂質(zhì)代謝、肝臟功能、胰島素抵抗指數(shù)及肝組織病理等各項(xiàng)指標(biāo)的影響(實(shí)驗(yàn)3-5)實(shí)驗(yàn)第12周時(shí)，先A方后B方治療組降低NAFLD大鼠血清TG、TCH、LDL、FFA、TNF-α、ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL、INS、IR、肝指數(shù)及肝組織MDA含量；提高NAFLD大鼠的肝組織SOD、GSH-ST含量的療效顯著優(yōu)于其他治療組(P<0.05或P<0.01)。在病理影響方面，先A方后B方治療組減輕NAFLD大鼠肝細(xì)胞脂肪變，

11、降低炎癥活動(dòng)度的療效與其他治療組相比有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。 第三部分：肝線粒體在NAFLD中的病理改變、基因表達(dá)及中醫(yī)多法干預(yù)的影響(實(shí)驗(yàn)6-7)。 1、正常組相比，肝細(xì)胞線粒體在各造模組中有不同程度的病理改變。在12周時(shí)，藥物B方治療組肝細(xì)胞線粒體增生復(fù)制活躍，未見明顯形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變，與模型組、對照藥物組、藥物A方治療組比較，其保護(hù)肝線粒體的療效較優(yōu)。 2、與正常組相比，NAFLD模型大

12、鼠肝線粒體細(xì)胞色素氧化酶COX II、IIImRNA、COXI蛋白低表達(dá)；藥物B方治療組提高肝線粒體細(xì)胞色素氧化酶COX I蛋白和COXIImRNA表達(dá)的療效顯著優(yōu)于其他治療組(P<0.05或P<0.01)。 結(jié)論： 1.動(dòng)物模型的建立采用高脂飼料復(fù)制大鼠NAFLD動(dòng)物模型，在實(shí)驗(yàn)第8周時(shí)，模型組大鼠肝組織病理改變符合單純性脂肪肝病變；實(shí)驗(yàn)第12周時(shí)，模型組大鼠肝功能損害，血脂增高，肝臟的病理變化符合NASH病理表現(xiàn)，成

13、功復(fù)制了大鼠NAFLD模型。 2.NAFLD的病理機(jī)制和中醫(yī)證型的研究。 2.1不同階段NAFLD發(fā)病機(jī)制的變化及中醫(yī)證型的演變。在大鼠NAFLD模型實(shí)驗(yàn)第8周時(shí)，大鼠肝臟病理主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞大泡性脂肪變，為NAFLD單純性脂肪肝階段，中醫(yī)多種治法干預(yù)的結(jié)果表明，在此階段以疏肝健脾、活血化瘀、化痰利濕為治法的干預(yù)措施療效較佳；在實(shí)驗(yàn)第12周時(shí)，大鼠肝臟病理表現(xiàn)為肝細(xì)胞混合性脂肪變，匯管區(qū)中度炎癥改變，為NAFLD脂肪性肝

14、炎階段表現(xiàn)，中醫(yī)干預(yù)結(jié)果表明，以化痰消瘀、清熱利濕、補(bǔ)益肝腎為治法的療效較優(yōu)。在單純性脂肪肝時(shí)期，胰島素抵抗、脂肪酸代謝失衡是脂肪肝的主要發(fā)病因素，脂質(zhì)過氧化、氧應(yīng)激，各種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)為病變進(jìn)展為NASH的主要發(fā)病機(jī)制。中醫(yī)不同治法在NAFLD各時(shí)期的療效差異表明，NAFLD的中醫(yī)證型在基本病機(jī)痰濕阻滯、瘀血阻絡(luò)的基礎(chǔ)上，在單純性脂肪肝階段兼有肝郁脾虛；在脂肪性肝炎階段兼有濕郁化熱、肝腎不足的特點(diǎn)。 2.2肝線粒體在N

15、AFLD發(fā)病中的作用機(jī)制。線粒體脂肪酸氧化代謝功能受損，清除自由基能力減低，是引起脂質(zhì)代謝失調(diào)，過氧化損傷、氧應(yīng)激的重要因素，也是導(dǎo)致NAFLD病情進(jìn)展的重要原因之一。 3.中醫(yī)辨證治療對NAFLD的防治作用及機(jī)理。 3.1中醫(yī)不同治法對NAFLD各階段干預(yù)的影響。中醫(yī)根據(jù)NAFLD發(fā)病過程中的臨床表現(xiàn)將其證型分為肝郁脾虛、痰濕阻滯、瘀血阻絡(luò)、濕郁化熱、肝腎不足等，根據(jù)病機(jī)不同分別用疏肝健脾、活血化瘀、化痰利濕、清利濕熱

16、、補(bǔ)益肝腎等治法進(jìn)行干預(yù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在大鼠NAFLD模型的早期階段采用疏肝健脾、活血化瘀、化痰利濕的治法有較好療效，在后期階段運(yùn)用化痰消瘀、清熱利濕、補(bǔ)益肝腎的治法療效較好。中醫(yī)各治法的療效主要表現(xiàn)在改善肝功能、肝指數(shù)和肝臟炎癥活動(dòng)度，降低炎癥因子水平、游離脂肪酸、血清脂質(zhì)水平、提高抗氧自由基能力等方面。 3.2中醫(yī)辨證干預(yù)NAFLD的防治機(jī)理。采取早期階段運(yùn)用疏肝健脾、活血化瘀、化痰利濕治法，結(jié)合后期階段化痰消瘀、清熱利濕、

17、補(bǔ)益肝腎的治療措施在防治NAFLD的過程中取得了最佳治療效果，防治NAFLD的機(jī)理表現(xiàn)在降低血脂、低密度脂蛋白、游離脂肪酸、炎癥因子水平，減輕脂質(zhì)過氧化損傷、肝臟炎癥活動(dòng)度，改善胰島素抵抗等方面。 3.3肝線粒體在NAFLD中的變化及中藥的干預(yù)機(jī)制。細(xì)胞色素氧化酶(COX)是衡量線粒體氧化能力的關(guān)鍵酶，大鼠COX基因、蛋白的表達(dá)下降，表明線粒體氧化代謝功能受損，清除自由基能力減低，是導(dǎo)致脂質(zhì)代謝失調(diào)，過氧化損傷的主要因素，中藥干