白術(shù)黃芪方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎及緊密連接相關(guān)蛋白影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、研究背景與目的：脾虛證反映了以消化系統(tǒng)功能障礙為主的全身性綜合病理狀態(tài)，有消化吸收功能障礙、胃腸屏障功能低下等表現(xiàn)。脾虛證主要以益氣健脾法治療，代表藥物有黨參、白術(shù)、黃芪、茯苓、甘草等，以其為主組成的經(jīng)典方劑有四君子湯、補(bǔ)中益氣湯、參苓白術(shù)散、黃芪建中湯等。許多研究表明，脾虛患者和脾虛動(dòng)物存在腸上皮細(xì)胞形態(tài)和功能的病變，通過(guò)益氣健脾方藥治療可得到明顯改善。表明這類中藥有維持腸上皮完整、改善上皮細(xì)胞功能和保護(hù)腸粘膜等作用。但國(guó)內(nèi)對(duì)益氣

2、健脾中藥腸粘膜修復(fù)作用機(jī)理的研究不多。 本實(shí)驗(yàn)室近年來(lái)開(kāi)展了相關(guān)研究，以化學(xué)方法提取得到黨參、白術(shù)、黃芪和甘草的提取部位18個(gè)，發(fā)現(xiàn)一些提取部位能促進(jìn)小腸隱窩IEC-6細(xì)胞增殖、移行、分化，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(ODC)、絨毛蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等表達(dá)，提高多胺(腐胺)含量等，最后篩選出3個(gè)有較強(qiáng)藥理活性的提取部位白術(shù)AMPS-Ⅱ、黃芪總皂苷、甘草總黃酮，并對(duì)其進(jìn)行了提取工藝研究，各有效組分均達(dá)到中藥新藥有效部位的要求，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中

3、以均勻設(shè)計(jì)法得出其最佳配伍比例，設(shè)立了由白術(shù)AMPS-Ⅱ、黃芪總皂苷、甘草總黃酮組成的白術(shù)黃芪方提取物新組方(以下簡(jiǎn)稱白術(shù)黃芪方)。組方思路源自金元醫(yī)家劉完素的白術(shù)黃芪湯，其《素問(wèn)病機(jī)氣宜保命集·瀉痢論》曰：“白術(shù)黃芪湯：服前藥，痢雖己除，猶宜此藥和之?！仔g(shù)一兩，黃芪七錢，甘草三錢?！卑丛乃觯仔g(shù)黃芪湯主要在瀉痢已除之后應(yīng)用，以達(dá)調(diào)理脾胃、“和之”的目的，類似瀉痢恢復(fù)期和潰瘍性結(jié)腸炎緩解期的治療。其療效可能與促進(jìn)腸粘膜修復(fù)、保護(hù)

4、腸上皮屏障的相關(guān)。因此益氣健脾中藥的作用靶點(diǎn)除了ODC和多胺等機(jī)制外，腸上皮細(xì)胞連接作為腸粘膜屏障的重要組成部分也可能是其靶點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)室最近觀察了白術(shù)黃芪方對(duì)細(xì)胞緊密連接及其相關(guān)蛋白ZO-1的影響，結(jié)果表明該方可促進(jìn)腸上皮Caco-2細(xì)胞增殖，增強(qiáng)ZO-1蛋白表達(dá)，白術(shù)AMPS-Ⅱ和黃芪皂苷可促進(jìn)腸上皮細(xì)胞連接的形成從而促進(jìn)細(xì)胞分化(尚未發(fā)表資料)。 在以上工作基礎(chǔ)上，本研究根據(jù)白術(shù)黃芪湯的臨床功用，選擇腸粘膜損傷性疾病潰瘍

5、性結(jié)腸炎(屬于中醫(yī)“下痢”范疇)為研究對(duì)象，考察白術(shù)黃芪方經(jīng)過(guò)藥物提取、篩選、組方后的白術(shù)黃芪方，新方與原方湯劑比較，其適應(yīng)癥、藥效、毒性等情況。研究目的是觀察白術(shù)黃芪方是否使療效增加而不引起毒性增加，是否保留其治療瀉痢恢復(fù)期脾胃虛弱的功效，是否保持中藥配伍組方能增效的特點(diǎn)，其作用機(jī)理是否與腸上皮細(xì)胞緊密連接及其相關(guān)蛋白(選擇構(gòu)成緊密連接的重要蛋白claudin-1、occludin)有關(guān)等。研究?jī)?nèi)容包括建立適用于中醫(yī)藥治療漬結(jié)病程發(fā)展

6、特點(diǎn)的動(dòng)物模型；比較白術(shù)黃芪方和白術(shù)黃芪湯治療潰瘍性結(jié)腸炎的療效及其毒性；觀察白術(shù)黃芪方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎不同病變階段的療效及其對(duì)claudin-1、occludin蛋白的影響，以考察該方益氣健脾治療潰瘍性結(jié)腸炎恢復(fù)期的功效及其對(duì)腸粘膜屏障可能的作用機(jī)理。本研究在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)方法進(jìn)行觀察，研究結(jié)果有助于闡述益氣健脾中藥治療腸道疾病的作用機(jī)理和物質(zhì)基礎(chǔ)。 二、研究方法1、三硝基苯磺酸致大鼠潰瘍性結(jié)腸炎建模方法的改良為

7、了使動(dòng)物模型更加接近臨床潰瘍性結(jié)腸炎緩解期的情況，模擬白術(shù)黃芪湯“痢雖已除，猶宜此藥和之”的方證，用于研究觀察白術(shù)黃芪方(湯)的療效及其作用機(jī)制。 2、白術(shù)黃芪方與白術(shù)黃芪湯治療大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的療效比較大鼠TNBS(50mg/kg)造模后，分為模型組、白術(shù)黃芪方0.3g/kg組、白術(shù)黃芪湯15g/kg組，每組16只大鼠，灌胃給藥14天后處死。觀察大鼠一般狀態(tài)、結(jié)腸病變的肉眼評(píng)分、組織病理學(xué)評(píng)分以及超微結(jié)構(gòu)，比較在兩藥在使用藥材

8、量大致相當(dāng)?shù)那闆r下其療效的差異。 3、白術(shù)黃芪方拆方對(duì)結(jié)腸炎小鼠髓過(guò)氧化物酶的影響TNBS致小鼠結(jié)腸炎模型，觀察白術(shù)AMPS-Ⅱ、黃芪總皂苷、甘草總黃酮、白術(shù)AMPS-Ⅱ+黃芪總皂苷、白術(shù)黃芪方(以上5組劑量均為0.2g/kg)對(duì)小鼠髓過(guò)氧化物酶的影響，另設(shè)模型組、陽(yáng)性對(duì)照藥潑尼松組、正常組。各組灌胃10天后處死小鼠，取結(jié)腸勻漿測(cè)髓過(guò)氧化物酶(MPO)。 4、白術(shù)黃芪方對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎不同病變階段病變的影響TNBS致潰

9、瘍性結(jié)腸炎大鼠分為模型組和白術(shù)黃芪方組，每組48只大鼠，造模后分別灌胃給藥，兩組各在造模的實(shí)驗(yàn)早、中、后期(10天、20天、30天)分3批處死大鼠，另設(shè)正常對(duì)照組，觀察大鼠一般狀態(tài)、結(jié)腸病變的肉眼和組織病理學(xué)評(píng)分情況，以考察白術(shù)黃芪方對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎急性期、緩解期和恢復(fù)期的影響。 5、白術(shù)黃芪方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎緊密連接相關(guān)蛋白claudin-1、occludin的影響“實(shí)驗(yàn)4”的大鼠結(jié)腸標(biāo)本以免疫熒光法檢測(cè)claudin-1、o

10、ccludin的表達(dá)，考察大鼠潰瘍性結(jié)腸炎claudin-1、occludin蛋白表達(dá)情況，白術(shù)黃芪方對(duì)其表達(dá)有否影響。 6、白術(shù)黃芪方與白術(shù)黃芪湯急性毒性試驗(yàn)白術(shù)黃芪方與白術(shù)黃芪湯一次灌胃均不引起小鼠死亡，故測(cè)一次最大耐受量。以兩藥最大濃度最大體積給小鼠一次灌胃，正常飼養(yǎng)7天以觀察其毒性反應(yīng)。 三、研究結(jié)果1、建立TNBS致大鼠潰瘍性結(jié)腸炎改良模型方案1：死亡率90％(9/10)，結(jié)腸肉眼評(píng)分5.9±0.3。方案2：死

11、亡率66.7％(6/9)，結(jié)腸肉眼評(píng)分5.0±1.7。方案3：死亡率18.2％(2/11)，結(jié)腸肉眼評(píng)分4.3±1.3。方案4：死亡率37.5％(6/16)，結(jié)腸肉眼評(píng)分4.0±1.8。提示造模方案可選擇SD大鼠體重220-240g，TNBS劑量50-60mg/kg，死亡率控制在20％以內(nèi)比較合適。 2、白術(shù)黃芪方與白術(shù)黃芪湯治療大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的療效比較實(shí)驗(yàn)結(jié)束后結(jié)腸肉眼評(píng)分：模型組4.0±1.8，白術(shù)黃芪方組2.8±1.5，

12、白術(shù)黃芪湯組3.4±1.7，經(jīng)秩和檢驗(yàn)白術(shù)黃芪方組與模型組比較P＜0.05；病理組織學(xué)評(píng)分：模型組4.7±1.2，白術(shù)黃芪方組3.1±1.6，白術(shù)黃芪湯組4.6±1.4，經(jīng)秩和檢驗(yàn)白術(shù)黃芪方組與模型組、白術(shù)黃芪湯組比較均P＜0.05。表明白術(shù)黃芪方治療大鼠潰結(jié)的療效優(yōu)于白術(shù)黃芪湯。結(jié)腸超微結(jié)構(gòu)觀察表明大鼠潰瘍性結(jié)腸炎有緊密連接形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞，白術(shù)黃芪方治療后能得到改善。 3、白術(shù)黃芪方提取部位單用及配伍組方對(duì)結(jié)腸炎小鼠MPO的影

13、響模型組MPO明顯高于正常組，表明造模成功。白術(shù)AMPS-Ⅱ、白術(shù)AMPS-Ⅱ+黃芪總皂苷、白術(shù)黃芪方都能降低MPO含量(P＜0.05-0.01)，表明對(duì)小鼠結(jié)腸炎有抗炎作用；白術(shù)AMPS-Ⅱ+黃芪總皂苷組效果略優(yōu)于白術(shù)AMPS-Ⅱ組，白術(shù)黃芪方組效果最好。單用黃芪總皂苷、甘草總黃酮?jiǎng)t對(duì)MPO無(wú)明顯影響。 4、白術(shù)黃芪方對(duì)不同病變階段大鼠潰瘍性結(jié)腸炎病變的影響實(shí)驗(yàn)10天、20天、30天，結(jié)腸肉眼評(píng)分：模型組為5.2±1.0，4.

14、3±1.3，3.5±1.6；白術(shù)黃芪方組為4.5±1.5，3.8±1.7，2.6±1.5，白術(shù)黃芪方與同時(shí)段的模型組比較秩和檢驗(yàn)，造模30天時(shí)P＜0.05；病理組織學(xué)評(píng)分：模型組為7.8±0.6，6.5±2.5，5.6±1.7，白術(shù)黃芪方組為8.0±0.0，6.4±1.3，4.9±2.0；白術(shù)黃芪方組與同時(shí)段的模型組比較P＞0.05。 5、白術(shù)黃芪方對(duì)大鼠潰結(jié)緊密連接相關(guān)蛋白claudin-1、occludin的影響在“實(shí)驗(yàn)4”

15、的結(jié)腸標(biāo)本中，組織病理學(xué)情況包括正常組織、潰結(jié)病灶部位(原有組織結(jié)構(gòu)被破壞，明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)、滲出、壞死、或有肉芽組織增生、潰瘍修復(fù)、早期瘢痕形成等)、潰結(jié)病灶邊緣組織(局部可見(jiàn)原有的組織結(jié)構(gòu)如腸粘膜、粘膜下層、肌層等，但有炎細(xì)胞浸潤(rùn))、離潰結(jié)病灶較遠(yuǎn)的部位(原有的組織結(jié)構(gòu)基本保留，炎細(xì)胞浸潤(rùn)相對(duì)較少)。 6、白術(shù)黃芪方與白術(shù)黃芪湯急性毒性試驗(yàn)白術(shù)黃芪方與白術(shù)黃芪湯灌胃后小鼠活動(dòng)正常，無(wú)一死亡。白術(shù)黃芪湯一次最大耐受量為60g生藥

16、/kg，相當(dāng)于臨床用量的180倍；白術(shù)黃芪方一次最大耐受量為4g提取物/kg，約相當(dāng)于180g生藥/kg。提示兩方臨床用量均在安全范圍。 四、結(jié)論1、TNBS致大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的病變從急性炎癥、組織壞死階段發(fā)展到慢性炎癥、潰瘍修復(fù)階段，與臨床潰瘍性結(jié)腸炎有相似之處，與中醫(yī)證型病機(jī)演變也有相符之處。但影響該模型病變程度的因素較多，包括造模劑量、實(shí)驗(yàn)周期、動(dòng)物體重與品種等，因此每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)以少量同批動(dòng)物做預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定正式實(shí)驗(yàn)的造模方案

17、。 2、白術(shù)黃芪方治療潰瘍性結(jié)腸炎的效果優(yōu)于白術(shù)黃芪湯；白術(shù)黃芪方有效部位配伍、組方后，其降低結(jié)腸炎小鼠髓過(guò)氧化物酶的作用優(yōu)于單用，提示用方劑中各藥的有效部位進(jìn)行配伍組方，達(dá)到了增效的目的；白術(shù)黃芪方經(jīng)有效部位提取后沒(méi)有增加毒性。 3、大鼠潰瘍性結(jié)腸炎可見(jiàn)腸上皮細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)形態(tài)的破壞，白術(shù)黃芪方治療后獲得改善，推測(cè)其作用機(jī)理可能與該方對(duì)緊密連接相關(guān)蛋白claudin-1、occludin的影響有關(guān)。但“實(shí)驗(yàn)5”的結(jié)果